[发明专利]一种基因融合的微流控检测设备及其使用方法

权利要求书

1.一种基因融合的微流控检测设备，融合基因包括相互连接的片段A和片段B，片段A和片段B分别位于融合位置上游和下游，所述片段B为野生型基因的一个DNA片段，野生型基因还包括片段B’，片段B’和片段B相互连接且分别位于断裂位点上游和下游，其特征在于，检测设备包括微流控芯片、捕获链、探针和PCR反应体系；

微流控芯片包括功能化的基板和微通道板，微通道板包括第一表面和与第一表面相对的第二表面，微通道板的第一表面上设置有至少两条不交叉的凹槽，在凹槽的两端设有贯穿第一表面和第二表面的通孔；微通道板的第一表面与功能化的基板密封接合，微通道板和基板之间形成供流体流通的微通道阵列，微通道阵列由至少两条不交叉微通道组成，微通道板和基板之间可拆卸；所述功能化的基板为表面具有醛基化修饰的基板；

捕获链包括第一捕获链和第二捕获链，第一捕获链与片段A的正义链互补，第二捕获链与片段B’的正义链互补；捕获链由如下方法固定在基板上：将微通道板的第一表面与功能化的基板密封接合，第一次形成微通道阵列，第一次形成的微通道阵列中的微通道包括Ⅰ类微通道和Ⅱ类微通道两部分；将含第一捕获链的溶液注入Ⅰ类微通道，并将含第二捕获链的溶液注入Ⅱ类微通道，使捕获链固定在基板上，在基板上形成捕获链条带，然后将微通道板从基板上拆卸；

PCR反应体系包括第一PCR反应体系和第二PCR反应体系，第一PCR反应体系用于获得第一PCR产物，第二PCR反应体系用于获得第二PCR产物；

第一PCR反应体系包括第一引物对，第二PCR反应体系包括第二引物对；第一引物对用于扩增融合基因片段，融合基因片段由相互连接的片段A和片段B组成；第二引物用于扩增野生型基因片段，野生型基因片段由相互连接的片段B和片段B’组成；

在基板上形成捕获链条带之后，第一PCR产物和第二PCR产物均用于与捕获链接触；第一PCR产物或第二PCR产物由如下方式与捕获链接触：将微通道板的第一表面与固定有捕获链条带的基板密封接合，第二次形成微通道阵列，第二次形成的微通道阵列中的微通道与捕获链条带之间形成交叉，交叉点为检测位点；在第二次形成的微通道阵列的微通道中注入单链化的第一PCR产物和/或单链化的第二PCR产物；第二次形成的微通道阵列的微通道包括Ⅰ’类微通道和Ⅱ’类微通道两部分；

探针为连接有报告分子的单链DNA，包括第一探针和第二探针；第一探针与片段A的正义链互补，第一探针同片段A的结合区域和第一捕获链同片段A的结合区域相异，第二探针与片段B的正义链互补；探针用于确认已被捕获链所捕获的靶片段，探针由如下方式与靶片段结合：首先，单链化的第一PCR产物和/或单链化的第二PCR产物均与捕获链在微通道中接触并充分反应；然后，在Ⅰ’类微通道中注射入第一探针，并在Ⅱ’类微通道注射入第二探针，使第一探针与第一捕获链所捕获的片段A的正义链接触，并使第二探针与第一捕获链或第二捕获链所捕获的片段B的正义链接触。

2.根据权利要求1所述的一种基因融合的微流控检测设备，其特征在于，所述第二探针的两端的碱基均为G；所述捕获链的3’端通过间隔物连接有氨基。

3.根据权利要求2所述的一种基因融合的微流控检测设备，其特征在于，第一引物对包括第一正向引物和第一反向引物，在第一PCR反应体系中第一正向引物的用量大于第一反向引物的用量；第二引物对包括第二正向引物和第二反向引物，在第二PCR反应体系中第二正向引物的用量大于第二反向引物的用量。

4.根据权利要求3所述的一种基因融合的微流控检测设备，其特征在于，所述微通道板的材料为聚二甲基硅氧烷。

5.根据权利要求4所述的一种基因融合的微流控检测设备，其特征在于，所述基板为载玻片。

6.根据权利要求5所述的一种基因融合的微流控检测设备，其特征在于，所述探针中的报告分子为生物素。

7.根据权利要求1-6中任一项权利要求所述的一种基因融合的微流控检测设备，其特征在于，所述片段A为人类EML4基因的一个DNA片段，所述野生型基因为人类ALK基因，所述片段B和片段B’的连接位置在ALK基因上的第20外显子上。