[发明专利]一种肝素裂解酶突变体及其重组表达的方法

说明书

本发明公开了一种肝素裂解酶突变体及其重组表达的方法，属于生物工程技术领域。本发明提供的肝素裂解酶III有更高的催化效率和热稳定性，突变体S264F/Y490K/D321N的催化效率比原始菌株提高了1.68倍，更有利于低分子量肝素的制备。本发明还对来自变形拟杆菌来源的肝素裂解酶III进行了异源重组表达，胞内酶活可以达到4000U/L以上。

技术领域

本发明涉及一种肝素裂解酶突变体及其重组表达的方法，属于生物工程技术领域。

背景技术

肝素是一种异质性多分散的硫酸化多糖，是一种抗凝血药物。广泛用于内科和防止手术后血栓的形成。由于它的非均一性，肝素可显示出不同的生物活性：非分级肝素的在治疗过程中会带来一些副作用，如骨质疏松症、出血等；分子量低于6000D的小(低)分子肝素可降低这些副作用。

低分子量肝素的制备方法主要有化学解聚法、物理制备法、生物解聚法和合成制备法。肝素酶是一类能够特定切割肝素或硫酸乙酰肝素中α-1,4糖苷键并将其裂解成有活性寡糖片段的酶。肝素酶最初从肝素黄杆菌中分离得到，后来，在许多微生物中也发现了肝素酶，比如粪便拟杆菌、鞘胺醇杆菌、枯草芽孢杆菌。由于天然肝素酶的表达量低并且纯化操作繁琐且费用较高，因而肝素酶的异源重组表达是替代天然肝素酶的重要途径。现有的重组肝素酶普遍存在催化效率低，热稳定性低的问题，限制了其在制备肝素寡糖方面的应用。

发明内容

[技术问题]

本发明要解决的技术问题是：提高肝素裂解酶III的热稳定性及催化效率。

[技术方案]

本发明提供了一种肝素裂解酶III突变体，是将变形拟杆菌(Bacteroidesthetaiotaomicron)来源的肝素裂解酶III进行突变后得到的。变形拟杆菌来源的编码肝素裂解酶III的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。所述肝素裂解酶III突变体是从变形拟杆菌中获得肝素裂解酶III的原始DNA序列，并对原始DNA序列进行分析，然后，对特定位点进行突变后得到的突变体。所述肝素裂解酶III突变体的热稳定性得到了提高。

所述肝素裂解酶III突变体是在变形拟杆菌来源的肝素裂解酶III的基础上，

将第264位的丝氨酸(S)突变为苯丙氨酸(F)；

或者，将第264位的丝氨酸(S)突变为苏氨酸(T)；

或者，将第321位的天冬氨酸(D)突变为谷氨酰胺(Q)；

或者，将第321位的天冬氨酸(D)突变为天冬酰胺(N)；

或者，将第490位的酪氨酸(Y)突变为赖氨酸(K)；

或者，将第264位的丝氨酸(S)突变为苯丙氨酸(F)并将第321位的天冬氨酸(D)突变为谷氨酰胺(Q)；

或者，将第264位的丝氨酸(S)突变为苯丙氨酸(F)并将第321位的天冬氨酸(D)突变为天冬酰胺(N)；

或者，将第264位的丝氨酸(S)突变为苏氨酸(T)并将第490位的酪氨酸(Y)突变为赖氨酸(K)；

或者，将第264位的丝氨酸(S)突变为苯丙氨酸(F)、将第490位的酪氨酸(Y)突变为赖氨酸(K)并将第321位的天冬氨酸(D)突变为天冬酰胺(N)；

分别得到突变体S264F、S264T、D321Q、D321N、Y490K、S264F/D321Q、S264F/D321N、S264T/Y490K、S264F/Y490K/D321N；

变形拟杆菌来源的编码肝素裂解酶III的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。