[发明专利]一种解脂耶氏酵母中目的基因多次无痕整合系统及方法

权利要求书

1.一种解脂耶氏酵母中目的基因多次无痕整合系统，其特征在于，所述系统包括质粒1、质粒2和质粒3；

所述质粒1包括酵母筛选标记、Cre基因表达盒、细菌部分基因片段、同源片段A和两个同向lox位点；两个同向lox位点设在同源片段A两侧，其余元件无顺序要求；两个同向lox位点整合到酵母基因组后发生重组反应，反应后在基因组上生成一个左臂突变型lox位点或一个右臂突变型lox位点；所述同源片段A为解脂耶氏酵母基因组序列，长度不小于1000bp；

所述质粒2包括酵母筛选标记、Cre基因表达盒、细菌部分基因片段、同源片段B、两个反向互补的左或右臂突变lox位点和目的基因表达盒；两个反向互补的左或右臂突变lox位点需在目的基因表达盒两侧，且紧靠同源片段B，其余元件无顺序要求；两个反向互补的左或右臂突变lox位点能够与质粒1反应后在基因组上生成的左或右臂突变型lox位点发生重组反应，反应后在基因组生成双臂突变型位点；所述同源片段B位于同源片段A上游或下游序列，长度不小于1000bp；

所述质粒3包括酵母筛选标记、Cre基因表达盒、细菌部分基因片段、同源片段B、两个反向互补的左或右臂突变lox位点和目的基因表达盒；两个反向互补的左或右臂突变lox位点需在目的基因表达盒两侧，且紧靠同源片段B，其余元件无顺序要求；两个反向互补的左或右臂突变lox位点能够与质粒2反应后在基因组生成的左或右臂突变型lox位点发生重组反应，反应后在基因组生成双臂突变型位点；同源片段B位于同源片段A上游或下游序列，长度不小于1000bp；

所述酵母筛选标记包括营养缺陷型标记和抗生素抗性标记；

所述Cre基因表达盒由诱导启动子-Cre基因-终止子组成；

所述细菌部分基因片段包括大肠杆菌复制起点和抗性基因。

2.根据权利要求1所述的系统，其特征在于，所述质粒1中的两个同向lox位点包括四个组合：5’-左臂突变型lox位点和3’-左臂突变型lox位点的组合、5’-左臂突变型lox位点和3’-野生lox位点的组合、5’-右臂突变型lox位点和3’-右臂突变型lox位点的组合以及5’-野生lox位点和3’-右臂突变型lox位点的组合。

3.根据权利要求1或2所述的系统，其特征在于，当所述质粒1中的两个同向lox位点为5’-左臂突变型lox位点和3’-左臂突变型lox位点的组合或5’-左臂突变型lox位点和3’-野生lox位点的组合时，质粒1反应后在基因组上生成一个左臂突变型lox位点，质粒2含两个反向互补的右臂突变lox位点，质粒3含两个反向互补的左臂突变lox位点；当所述质粒1中的两个同向lox位点为5’-右臂突变型lox位点和3’-右臂突变型lox位点的组合或5’-野生lox位点和3’-右臂突变型lox位点的组合时，质粒1反应后在基因组上生成一个右臂突变型lox位点，质粒2含两个反向互补的左臂突变lox位点，质粒3含两个反向互补的右臂突变lox位点。

4.根据权利要求1所述的系统，其特征在于，同源片段B位于同源片段A的相对位置影响质粒2和质粒3中同源片段B、两个反向互补的左或右臂突变lox位点、目的基因表达盒的相对位置：

当所述同源片段B位于同源片段A下游序列时，5’到3’的顺序为：lox位点1-目的基因表达盒-lox位点2-同源片段B；

当所述同源片段B位于同源片段A上游序列时，5’到3’的顺序为：同源片段B-lox位点2-目的基因表达盒-lox位点1；

同一质粒中，所述lox位点1和lox位点2反向互补；

质粒2中同源片段B紧邻lox反向互补序列，质粒3中同源片段B紧邻lox位点；

质粒2中的lox位点1与质粒1反应后在基因组上生成的lox位点同向，但突变型相反：一个为左臂突变型，一个为右臂突变型；

质粒3中的lox位点与质粒1反应后在基因组上生成的lox位点方向相反，但突变型相同：同为左臂突变型或同为右臂突变型。