[发明专利]一种间充质干细胞无血清培养基

说明书

本发明提供了一种间充质干细胞无血清培养基，其具体包括脂类混合物、谷氨酰胺、氢化可的松、硫酸锌、丁酸钠、柠檬酸铁、维生素C、重组人表皮生长因子、重组人碱性成纤维细胞生长因子、RGD短肽、棕榈酰三肽‑5、棕榈酰四肽‑7、氯化锂、L‑谷胱甘肽、大豆胰酶抑制剂、β‑巯基乙醇、乙醇胺、亚硒酸钠、Hepes、碳酸氢钠和基础培养基。本申请提供的无血清培养基无人源、无动物源、化学成分明确、营养丰富，能够实现UC‑MSCs快速增殖，解决细胞数量不够问题的同时，维持间充质干细胞生物特性和免疫表型稳定性。

技术领域

本发明涉及培养基技术领域，尤其涉及一种间充质干细胞无血清培养基。

背景技术

间充质干细胞(Mesenchymal stem cells, MSCs)来源于发育早期的中胚层，是一类非造血干细胞，其广泛存在于骨髓、皮下脂肪、骨外膜、肌肉、滑膜、滑液、肝脏、外周组织、脐带、脐带血及胎盘等组织。MSCs具有高度自我更新能力、多向分化潜能，可在体外培养扩增，不仅能够支持造血干细胞的生长，还具有免疫调控的作用；不同的诱导条件下，在体外可分化为骨、软骨、肌肉、神经、心肌、内皮和脂肪等，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能，可作为理想的种子细胞用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复。因此，MSCs具有广阔的临床应用前景，是细胞替代治疗和组织工程的首选种子细胞，是移植领域和自身性免疫疾病治疗的研究热点。

脐带组织属于常规医疗废弃物，来源丰富、易于采集运输，且完全没有伦理学争议，是目前最佳的MSCs来源。与骨髓等其它组织来源的MSCs相比较，UC-MSCs具有分离方法简单、成功率高、分离后细胞纯度高等优点，目前被应用于多种疾病的临床研究。

现有的间充质干细胞培养方法使用的培养基大都含有动物血清，如最为常见的胎牛血清（fetal bovine serum, FBS）。FBS成分复杂且含有异种蛋白质，容易携带病毒或被支原体感染等。另一方面，FBS批间差异较大，来源不稳定，对体外大规模扩增MSCs工艺影响较大。目前有研究表明，MSCs在培养过程中会吞噬培养基中的蛋白质，培养基中含有牛血清白蛋白，可使受者体内产生抗牛白蛋白抗体引起免疫反应，从而导致尤其是在重复输注MSCs治疗后失效。因此，越来越多研究人员及企业开始研发FBS的替代物。目前市面上血清替代物种类较多，但大都仍然含有一些动物源成分，如Ultroser G（Pall BioSepra）。部分血清替代物会使用人血清活血请衍生物，包括人源血清、血小板衍生物、脐血清等。这些产品随来源于人，但成分仍然不明确，而且资源少，难于实现量产，无法保证MSCs体外大规模培养。

无血清培养基（Serum-Free Medium，SFM），顾名思义是指在细胞培养中不需要添加动物或人源血清。但为了满足细胞生长的要求，通常会向培养基中添加替代血清功能的原料，主要包括结合蛋白、生长因子、粘附因子、激素以及微量元素等加大类别。应用于间充质干细胞的SFM的研发至今，主要经历了四大阶段。第一代是一般意义上的无血清培养基，采用各种可替代血清功能的生物材料，含大量动物来源蛋白和不明成分，如动物或人源血小板裂解物等；其优点是相较于含血清培养基，实验准确性、可重复性、稳定性高一些，但由于添加物质的化学成分不明确，大部分含大量动物源蛋白，不利于目标蛋白的分离纯化，而且成本较高。第二代是无血清无动物源蛋白培养基，其添加成分完全不用动物来源于蛋白，取而代之的是各种重组蛋白或动植物蛋白水解物；其优势是稳定性较第一代有所提高，降低了成本，效果也相应提高，但由于成本极高，仅适合需求量少的科研用户，难于被开展大规模生产的企业所使用。第三代是成分限定培养基，又称双无培养基；添加成分完全不含血清、无蛋白或蛋白含量极低，且所含蛋白是成分明确的；第三代SFM优势十分明显，细胞培养与生产易做到恒定，目标蛋白的分离纯化更为容易，成本大为下降，但目前阶段此类产品均具有细胞传代能力不足的缺点，这也是目前SFM研发企业急需突破的瓶颈，而且对培养的细胞具有很高的特异性，所以适于培养的细胞系较少，产品开发难度极大。第四代是化学组分限定培养基，添加成分不含血清、不含任何蛋白，主要由化合物代替不稳定的蛋白类物质，可高温消毒，适合多种不同细胞生长的全能型培养基；目前暂无此类产品上市，仍处于研发阶段。