[发明专利]一种铵态氮高效利用的核桃砧木培育方法

说明书

本发明公开了一种铵态氮高效利用的核桃砧木培育方法，包括以步骤：1)RNA提取；2)总RNA反转录cDNA；3)PCR扩增；4)核桃JrAMT基因目的片段的回收；5)构建JrAMT‑pC1300过量表达载体；6)核桃JrAMT‑pC1300遗传转化；7)核桃JrAMT基因过量表达植株再生。本发明操作简便，无需昂贵精密的仪器设备，成本低，周期短，同时，再生植株能更高效地利用铵态氮，长势强、遗传稳定性好，苗木健壮、有良好的抗逆性，培育得到的JrAMT基因过量表达阳性再生核桃植株对铵态氮利用率显著高于野生型核桃植株。

技术领域

本发明涉及植物转基因领域，尤其是一种铵态氮高效利用的核桃砧木培育方法。

背景技术

氮素作为植物需求量最大的矿质元素，是作物高产、稳产的重要生理基础和关键限制因子，在光合作用、呼吸作用以及抗氧化系统等关键生理代谢过程中都具有十分重要的作用。研究表明，目前全世界每年施用氮肥超过1.2亿吨。然而，当前主要作物对氮素利用效率却极其低下，仅为33％，我国主要粮食作物的氮肥利用率更是远低于国际水平，部分蔬菜高产区氮肥利用率更低得惊人，仅为10％～20％。大量施用的氮肥在提高农作物产量的同时，也极大增加了生产成本，更导致了包括气候变化、土壤酸化及水体富营养化等在内的环境危机与生态灾难。目前，氮污染已被认为是21世纪人类环境面临的最大挑战之一。然而，另一方面，人口爆炸对作物以及果蔬的产量带来了巨大的需求，因此，如何培育氮素高效利用的农作物新种质已成为当前解决我国乃至世界农业环境与资源之间关键矛盾的重大课题。铵态氮(Ammonium N，NH4+-N)和硝态氮(Nitrate N，NO3--N)是植物吸收和利用的主要无机氮源，铵态氮被植物吸收后，可被直接同化为各种氨基酸，而硝态氮则须还原成铵态氮才能进入代谢过程，由此可见铵态氮是生物体内氮代谢的中心环节，铵态氮在植株体内的吸收和转运主要由铵转运蛋白(ammonium transporter，AMT)通过与其偶联的H+-ATPase所提供的细胞质膜内外化学渗透势梯度来介导。植物体内铵转运蛋白以基因家族的形式存在，进化分析显示植物铵转运蛋白家族可分为两大类：AMT1和AMT2。目前，关于AMT基因的报道大多限于草本植物。水稻是鉴定出铵转运蛋白最多的植物种属，水稻中共发现了十几个铵转运蛋白基因，如OsAMT:1、OsAMTl:4、OsAMT2:3、OsA MT3:1和OsAMT5等，OsMTI:4和OsAMT5具有使NH4+吸收缺陷的酵母突变体重新恢复吸收NH4+的能力,其中OsAMT5为叶特异表达，OsAMTI：4的表达会受到NH4+因子以外其他因素的调节；拟南芥中有AtAMTl:1、AtAMT1:5和AtAMT2等，其中的AtAMT1:3基因能介导铵的同系物甲基铵的吸收,对铵和甲基铵的吸收具有浓度依赖性和电压依赖性。但是，对木本果树AMT基因的研究却鲜有报道。

经检索，尚未发现有关基于过量表达AMT基因的核桃铵态氮高效利用方面的资料报道。因此，研发核桃过量表达AMT基因的铵态氮高效利用新种质，不但为核桃，还为木本果树铵态氮高效利用开劈了一条新途径或借鉴之路。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的是提供一种铵态氮高效利用的核桃砧木培育方法，能够针对当前作物对氮素利用效率低下，大量施用的氮肥增加了农业生产成本，更导致了包括气候变化、土壤酸化及水体富营养化等环境危机，依靠传统的核桃新品种选育方式，仍无法满足现实生产的需求。为此，本发明要解决的技术问题是提供一种过量表达铵转运蛋白基因的核桃嫁接砧木培育方法。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种铵态氮高效利用的核桃砧木培育方法，包括以下步骤：

1)RNA提取

对生长良好的核桃体细胞胚取样，进行总RNA提取，获得总RNA提取液；

2)总RNA反转录cDNA

将步骤1)得到的总RNA提取液进行逆转录得到cDNA；

3)PCR扩增