[发明专利]一种提高木糖利用率的基因、重组载体、重组细胞及应用方法在审
| 申请号： | 201910750854.4 | 申请日： | 2019-08-14 |
| 公开（公告）号： | CN110511949A | 公开（公告）日： | 2019-11-29 |
| 发明（设计）人： | 王志强;吕鑫;李刚;罗明刚;郑英敏;杨秋霞;吴泽华;孙敬善 | 申请（专利权）人： | 山东寿光巨能金玉米开发有限公司;寿光金远东变性淀粉有限公司;寿光金玉米生物科技有限公司;临清德能金玉米生物有限公司 |
| 主分类号： | C12N15/61 | 分类号： | C12N15/61;C12N15/70;C12N1/21;C12P13/08;C12N15/10;C12R1/19 |
| 代理公司： | 11777 北京艾皮专利代理有限公司 | 代理人： | 李德胜<国际申请>=<国际公布>=<进入 |
| 地址： | 262700 山东省潍坊*** | 国省代码： | 山东;37 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 基因 大肠杆菌 木糖利用率 重组载体 扩增 大肠杆菌感受态细胞 大肠杆菌工程菌 分子生物学领域 核苷酸序列 木糖异构酶 糖酸转化率 表达水平 代谢木糖 重组细胞 赖氨酸 热激法 构建 转化 应用 | ||
1.一种提高木糖利用率基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.含有权利要求1所述的提高木糖利用率基因的重组载体、重组细胞。
3.权利要求1所述的提高木糖利用率基因在利用秸秆水解液生产赖氨酸的大肠杆菌工程菌中的应用。
4.一种提高木糖利用率基因的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
获取枯草芽孢杆菌168和大肠杆菌基因；并根据枯草芽孢杆菌168 P43和大肠杆菌木糖异构酶基因序列设计扩增引物；
以枯草芽孢杆菌168基因为模板对P43基因进行扩增，获得P43启动子；
以大肠杆菌基因基因为模板，对大肠杆菌木糖异构酶基因进行扩增，获得大肠杆菌木糖异构酶基因片段；
以所述P43启动子和大肠杆菌木糖异构酶基因片段为模板，采用重叠扩增法获得提高木糖利用率基因。
5.根据权利要求4所述的提高木糖利用率基因的制备方法，其特征在于，所述获得P43启动子的扩增引物的基因序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示，扩增条件为：
预变性：95℃，5min；变性：95℃，1min，复性：55℃，30s，延伸：72℃，30s，30循环；后延伸：72℃， 10min。
6.根据权利要求4所述的提高木糖利用率基因的制备方法，其特征在于，所述获得大肠杆菌木糖异构酶基因片段的扩增引物的基因序列如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示，扩增条件为：
预变性：95℃，5min；变性：95℃，1min；复性：57℃，30s；延伸：72℃，1min；30循环；后延伸：72℃， 10min。
7.根据权利要求4所述的提高木糖利用率基因的制备方法，其特征在于，所述重叠扩增法中扩增引物为SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.5所示，扩增条件为：
预变性：95℃，5min；变性：95℃，1min；复性：56℃，30s；延伸：72℃，2min；30循环；后延伸：72℃，10min。
8.根据权利要求3所述的提高木糖利用率基因在利用秸秆水解液生产赖氨酸的大肠杆菌工程菌中的应用，其特征在于，所述应用的步骤如下：
将所述提高木糖利用率基因和质粒载体通过酶切、连接反应获得重组载体；
将所述重组载体通过热激法转化至大肠杆菌感受态细胞中，并进行阳性筛选获得大肠杆菌工程菌。
9.根据权利要求8所述的应用步骤，其特征在于，所述酶切过程中的酶切体系为：
限制性内切酶EcoRI和HindIII、内切酶缓冲溶液，双蒸水。
10.根据权利要求8所述的应用步骤，其特征在于，所述阳性筛选具体包括以下步骤：
将所述感受细胞涂布在含有25μg/mL链霉素的平板培养基上进行培养，获得单菌落记为含有提高木糖利用率基因的大肠杆菌工程菌。
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