[发明专利]一种用于海马药材鉴定的引物、DNA序列及鉴定方法

权利要求书

1.一种海马药材的分子鉴定方法，其特征在于，包括下列步骤：

1)用SDS裂解法提取待测海马药材的基因组DNA，保存于-20摄氏度；

2)采用ATP-F和ATP-R引物对步骤1)提取的基因组DNA作PCR扩增；

ATP-F：5'-CAACCCCTTGAAACTGACAATGACA-3'

ATP-R：5'-GCTTGRATTATAGCAACGGCTACTTC-3'；

3)扩增产物在琼脂糖凝胶上电泳，SYBRGreen染色，观察DNA扩增结果；

4)对扩增获得的DNA片段进行回收和纯化；

5)将纯化后DNA片段做双向测序反应；

6)将测得ATP6序列与SEQ ID NO：3-68作序列比对，计算遗传距离；

7)根据比对结果，判定待测海马样品的种类；

待测样品的ATP6序列与SEQ ID NO:3-13序列间的遗传距离小于或等于0.012，且ATP6序列与SEQ ID NO:14-68序列间的遗传距离大于或等于0.138，则待测海马样品就是三斑海马Hippocampustrimacu latus；

待测海马样品的ATP6序列与SEQ ID NO:14-25序列间的遗传距离小于或等于0.015，且ATP6序列与SEQ ID NO:3-13和SEQ ID NO:26-68序列间的遗传距离大于或等于0.094，则待测海马样品就是棘海马Hi ppocampusspinosissimus；

待测海马样品的ATP6序列与SEQ ID NO:26-35序列间的遗传距离小于或等于0.0101，且ATP6序列与SEQ ID NO:3-25和SEQ ID NO:36-68序列间的遗传距离大于或等于0.0597，则待测海马样品就是太平洋海马Hippocampusingens；

待测海马样品的ATP6序列与SEQ ID NO:36-47序列间的遗传距离小于或等于0.013，且ATP6序列与SEQ ID NO:3-35和SEQ ID NO:48-68序列间的遗传距离大于或等于0.155，则待测海马样品就是直立海马Hippocampuserectus；

待测海马样品的ATP6序列与SEQ ID NO:48-55序列间的遗传距离小于或等于0.003，且ATP6序列与SEQ ID NO:3-47和SEQ ID NO:56-68序列间的遗传距离大于或等于0.126，则待测海马样品就是鲍氏海马Hippocampusbarbouri。

2.根据权利要求1所述海马药材的分子鉴定方法，其特征在于，步骤2)所述PCR扩增体系为：反应总体系为50μL，其中10×PCRbuffer5μL，rTaq酶0.5μL，dNTPMix5μL，正向引物1μL，反向引物1μL，模板DNA200ng，加超纯水补充至50μl。

3.根据权利要求1所述海马药材的分子鉴定方法，其特征在于，步骤2)所述PCR扩增条件为：94℃预变性5分钟；94℃变性45秒，48-53℃退火1分钟，72℃延伸1分钟，35个循环；72℃延伸15分钟。