[发明专利]一种甲烷菌中高活性甲基辅酶M还原酶提取工艺

权利要求书

1.一种甲烷菌中高活性甲基辅酶M还原酶提取工艺，其特征在于：包括如下步骤：

S1、进行土壤和气体分析，培养甲烷菌；

S2、检测单不饱和脂肪酸异戊烯基侧链的碳氢化合物表示的乙酸分解的存在；

S3、从土壤中提取DNA；

S4、实时定量PCR和克隆库的分析甲基辅酶M还原酶；

S5、mcrA基因的克隆和测序后进行统计分析。

2.根据权利要求1所述的一种甲烷菌中高活性甲基辅酶M还原酶提取工艺，其特征在于，所述步骤S1中对于甲烷菌进行培育，甲烷菌是在厌氧环境发酵，在有机培养池中，填入土壤后加入有机物，接着加入有机肥，接着继续填充土壤覆盖住有机物，下压土壤，排出土壤中的空气，增强反硝化率，并且刺激微生物代谢，保持有机培养池温度在10-22度，检测甲烷菌数量与活性。

3.根据权利要求2所述的一种甲烷菌中高活性甲基辅酶M还原酶提取工艺，其特征在于，所述步骤S1中有机物为秸秆、牛粪便和河湖淤泥，所述秸秆、牛粪便和有机肥重量比例为2:1:1:0.5。

4.根据权利要求2所述的一种甲烷菌中高活性甲基辅酶M还原酶提取工艺，其特征在于，所述步骤S1中土壤中含量为60-80％砂，14-32％淤泥和6-14％粘土。

5.根据权利要求1所述的一种甲烷菌中高活性甲基辅酶M还原酶提取工艺，其特征在于，所述步骤S3中通过1000mg土壤中提取DNA，提取物的数量和质量采用分光光度法测定。

6.根据权利要求1所述的一种甲烷菌中高活性甲基辅酶M还原酶提取工艺，其特征在于，所述步骤S5中在ABI PRISM 7700序列检测系统进行，反应混合物含有5毫升的ROX，1.5毫克牛血清蛋白、5％二甲基亚砜、0.5毫升的DNA模板和水的最终体积25毫升。

7.根据权利要求6所述的一种甲烷菌中高活性甲基辅酶M还原酶提取工艺，其特征在于，所述步骤S4中具体操作步骤如下：

A1、由初始951度变性15min和941度变性1min4放大到在721度和521度各1分钟；

A2、通过使用10倍的稀释部分稀释马氏甲烷八叠球菌mcrA基因序列建立其标准曲线；

A3、计算出的PCR扩增效率使用的数据来自标准曲线和公式；

A4、DNA的提取物质影响废弃物质，对每个样品进行稀释，每个样品进行四个独立的测定，通过放大熔融的PCR产物的质量曲线和确认用1.5％溴化乙锭染色的琼脂糖凝胶。

8.根据权利要求7所述的一种甲烷菌中高活性甲基辅酶M还原酶提取工艺，其特征在于，所述步骤A3中公式为[10(A1/slope)]A1。

9.根据权利要求1所述的一种甲烷菌中高活性甲基辅酶M还原酶提取工艺，其特征在于，所述步骤S5中mcrA基因的克隆和测序具体包括如下步骤：

B1、选取四个反应盒中加入反应物；

B2、12H后进行分离后，通过测序仪进行测序；

B3、推导出序列，完成计算。

10.根据权利要求9所述的一种甲烷菌中高活性甲基辅酶M还原酶提取工艺，其特征在于，所述步骤B1中反应物为Ca50纳克，缓冲液1毫升、2.5毫升的无菌蒸馏水、2毫升矢量(PCR2.)和T4连接酶1毫升。