[发明专利]一种适用于尼罗罗非鱼、奥利亚罗非鱼及其杂交种的微卫星标记亲权鉴定引物、方法及应用

说明书

本发明公开了一种适用于尼罗罗非鱼、奥利亚罗非鱼及其杂交种的微卫星标记亲权鉴定引物、方法及应用，属于鱼类育种技术领域。本发明筛选了13对荧光标记微卫星引物用于亲权鉴定，该鉴定方法包括以下步骤：构建尼罗罗非鱼、奥利亚罗非鱼及其杂交种的全同胞家系；提取各家系亲本和子代基因组DNA；多态性微卫星标记的筛选；荧光标记微卫星引物PCR扩增；多重毛细管电泳分型和亲权鉴定。本发明首次建立了适用于尼罗罗非鱼、奥利亚罗非鱼及其杂交种的微卫星标记亲权鉴定方法，其鉴定准确率为100%，在实际应用中鉴定准确率可达99.43%。本发明鉴定准确率高、操作简便，可用于指导这三种罗非鱼在育种过程中的种群遗传和家系系谱管理。

技术领域

本发明属于鱼类育种技术领域的分子标志技术，具体涉及一种适用于尼罗罗非鱼、奥利亚罗非鱼及其杂交种的微卫星标记亲权鉴定引物、方法及应用。

背景技术

罗非鱼(Tilapia)是一种原产于非洲的热带性鱼类，隶属于鲈形目、鲈形亚目、丽鱼科(Cichlidae)、罗非鱼属(亦称丽鲷科，丽鲷属)，约有100余种。因其具有生长快、食性杂、繁殖力和适应力强、无肌间刺和味道鲜美等特点，1976年成为联合国粮农组织FAO向全世界推荐的优良养殖品种。目前已有75个国家和地区养殖罗非鱼，已成为一种世界性的淡水养殖鱼类。自1957年引种莫桑比克罗非鱼(Oreochromis mossambicus)以来，我国罗非鱼养殖产业不断发展壮大，目前我国已成为罗非鱼年产量世界第一的生产大国。2017年我国罗非鱼产量达158万吨，广东、海南、广西和云南等省份是我国罗非鱼的主要产地。

目前，我国罗非鱼成鱼养殖主要品种有尼罗罗非鱼吉富品系(O.niloticus,GIFTstrain)、奥尼罗非鱼(尼罗罗非鱼♀×奥利亚罗非鱼♂)和罗非鱼“粤闽1号”等。尼罗罗非鱼吉富品系是以四个非洲品系(埃及、肯尼亚、塞内加尔、加纳)和四个亚洲养殖品系(新加坡、泰国、以色列、中国台湾)的尼罗罗非鱼为基础群体，通过家系选育方法获得，其具有生长快、规格整齐、体形好、适应性强等优点，是我国目前养殖最为广泛的罗非鱼品种。但尼罗罗非鱼雄性率较低、抗病力较差，制约了我国罗非鱼养殖产量的进一步提高。通过遗传育种方法培育出生长速度快、雄性率高和抗病力强的罗非鱼新品种成为广大渔民的迫切需求和科研人员的研究的热点。奥利亚罗非鱼(O.aureus)虽然生长速度较慢，但由于其具有不同于尼罗罗非鱼的性别决定机制和抗病力强的特点，常常被用作全雄罗非鱼和抗病罗非鱼新品种培育的亲本。奥尼罗非鱼是由奥利亚罗非鱼为父本和尼罗罗非鱼为母本杂交获得的杂交种，其具有自然雄性率高、耐低氧和抗病力强等优点。罗非鱼“粤闽1号”(尼罗罗非鱼♀×超雄奥尼罗非鱼♂)是中国水产科学研究院珠江水产研究所近年来以尼罗罗非鱼和奥利亚罗非鱼为基础群体，通过群体选育、家系选育和杂交育种技等术培育而成的全雄罗非鱼新品种。在上述罗非鱼主要养殖品种的培育过程中，涉及到尼罗罗非鱼、奥利亚罗非鱼及其杂交种三种罗非鱼家系构建和种群遗传管理工作，操作不当容易导致种质混杂、遗传渐渗和过度近亲繁殖，从而出现鱼体生长速度减慢、成鱼规格差异大和抗病力减弱等种质退化现象，因此建立简便可靠、适用性较广的罗非鱼家系系谱分析方法具有重要意义。

在鱼类遗传育种研究中，清晰的系谱信息对于家系的选育和亲本的管理至关重要。以往主要通过分池养殖保种或采用电子标签标记等方法记录家系系谱信息，但分池保种需要占用大量池塘，成本较高；电子标签标记法虽然可以减少池塘的使用量，但标记工作量较大，且易出现标记丢失和鱼体损伤等现象。基于分子标记的鱼类亲权鉴定方法能够较好的避免以上传统系谱信息管理方法的弊端，其中微卫星标记法因具有数量多、分布广、多态性丰富、易检测、呈孟德尔共显性遗传等特点，成为目前在水生动物亲权鉴定中应用最为广泛的方法之一。在草鱼、凡纳滨对虾、建鲤、金乌贼、翘嘴鳜、大菱鲆和牙鲆等水生动物中均有微卫星亲权鉴定方法的报道，虽然在尼罗罗非鱼中已有微卫星亲权鉴定方法的报道，但在奥利亚罗非鱼和奥尼罗非鱼中未见有微卫星亲权鉴定方法的报道。本发明旨在利用荧光微卫星标记建立适用于尼罗罗非鱼、奥利亚罗非鱼及其杂交种的亲权鉴定方法，从而为其家系管理和种群遗传管理提供技术手段。

发明内容