[发明专利]一种山苍子叶肉细胞原生质体的制备方法

说明书

本发明公开的一种山苍子叶肉细胞原生质体的制备方法，包括以下步骤：获取无菌山苍子叶片；将无菌山苍子叶片切成条状碎块，置于酶解液中，黑暗条件下静置酶解6‑12小时，条状碎块与酶解液的质量体积比为1‑3：30‑50；将酶解完成后的酶解液进行过滤，取滤液经离心处理，弃上清液，得原生质体；在所得原生质体中加入原生质体洗涤液A，重悬原生质体；随后加入原生质体洗涤液B，离心后，收集液面分界处的原生质体细胞，即得。本发明提供的制备方法能够高效获取山苍子叶肉细胞原生质体，所得原生质体形态正常，无破损，每克鲜叶组织可获得(8.69±0.57)×10⁶个原生质体，为山苍子的基础研究和应用研究提供重要的技术支持。

技术领域

本发明涉及植物细胞原生质体制备技术领域，更具体地，涉及一种山苍子叶肉细胞原生质体的制备方法。

背景技术

山苍子(Litsea cubeba)是我国南方特有的工业原料和香料树种，其果实提炼的精油中柠檬醛含量极高，被广泛应用于医药、食品、化妆品等领域。然而目前与山苍子相关的基础研究还较为薄弱，这严重制约了山苍子产业的发展。植物细胞原生质体在基础研究和遗传育种工作中扮演着重要的角色，主要表现在以下几个方面：1、相对于完整的细胞而言，原生质体去除了细胞壁，从而更有利于细胞膜、细胞器和蛋白质亚细胞定位的观察；2、原生质体培养是植物无性扩繁的重要途径；3、原生质体是进行植物基因功能研究的重要转基因受体；4、原生质体是进行体细胞杂交育种的重要起始材料。基于上述原因，细胞原生质体已被广泛应用于植物科学研究的多个领域。然而到目前为止，尚未有能够高效获取山苍子叶肉细胞原生质体的相关内容；另外，相对于成功获得原生质体的植物而言，山苍子叶片组织中含有大量的次生代谢物，在进行细胞壁酶解时，破损的叶片组织释放的次生代谢物因长期暴露在空气中而被氧化，转变成大量毒害原生质体的褐化物，从而易导致山苍子原生质体分离失败；因此，如何采用一种高效经济的方法制备山苍子原生质体是目前所面临的研发难点。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种山苍子叶肉细胞原生质体的制备方法，以克服现有技术中的不足。

为实现上述目的，本发明的技术方案如下：

一种山苍子叶肉细胞原生质体的制备方法，包括以下步骤：

步骤一、材料选取：获取无菌山苍子叶片；

步骤二、叶片酶解：将所述无菌山苍子叶片切成条状碎块，置于酶解液中，黑暗条件下静置酶解6-12小时，所述条状碎块与所述酶解液的质量体积比为1-3：30-50，g/ml；所述酶解液中包括纤维素酶R-10、离析酶R-10、维生素C、PEG 4000和吐温80；

步骤三、原生质体分离：将酶解完成后的酶解液进行过滤，取滤液经离心处理，弃上清液，得原生质体；

步骤四、原生质体纯化：在步骤三所得原生质体中加入原生质体洗涤液A，重悬原生质体；随后加入原生质体洗涤液B，离心后，收集液面分界处的原生质体细胞，即得。

优选的，步骤一的具体操作为：采集长势良好、无病虫害的山苍子叶片，将采集的叶片用0.1％的升汞溶液灭菌3-5分钟，即得无菌山苍子叶片；或者利用组织培养技术获得无菌的山苍子培苗，以山苍子培苗的幼叶作为无菌山苍子叶片。

优选的，步骤二中，所述酶解液含有以下终浓度的各组分：10-20g/l纤维素酶R-10、10-20g/l离析酶R-10、91-128g/l甘露醇、0.1-0.3g/l磷酸二氢钠、1-2g/l吗啉乙磺酸、2-4g/l二水氯化钙、0.5-1g/l维生素C、1-5g/lPEG 4000和5-10g/l吐温80，所述酶解液的pH为5.8-6.0。

优选的，步骤三的具体操作为：将酶解完成后的酶解液经45微米孔径的不锈钢滤网过滤至离心管中，以800-1200rpm/min转速，离心3-6分钟，弃上清液，得原生质体。