[发明专利]一种基于酵母双杂交技术高效筛选膜蛋白互作蛋白的方法

权利要求书

1.一种基于酵母双杂交技术筛选膜蛋白互作蛋白的方法，该方法包括以下步骤：

步骤1、诱饵蛋白载体的选择：根据蛋白N端和C端在细胞质膜与胞质的定位以及蛋白N端是否存在信号肽来判断载体的选择，具体选择标准为当诱饵蛋白N端的定位在细胞外或胞腔内，且诱饵蛋白N端含信号肽，诱饵蛋白C端的定位在细胞质时，选择的载体为pBT3-SUC；当诱饵蛋白N端的定位在细胞外或胞腔内，且诱饵蛋白N端无信号肽，诱饵蛋白C端的定位在细胞质时，选择的载体为pBT3-STE；当诱饵蛋白N端的定位在细胞质，诱饵蛋白C端的定位在细胞外或胞腔内时，选择的载体为pBT3-N；当诱饵蛋白N端的定位在细胞质，诱饵蛋白C端的定位在细胞质时，选择的载体为pBT3-N或pBT3-STE；

步骤二、进行自激活检测及诱饵载体功能验证：以质粒pTSU2-APP和pPR3-N为阴性对照，质粒pTSU2-APP和pNubG-Fe65为阳性对照，进行阴阳对照，分析实验结果；

步骤三、进行膜体系双杂交文库筛选，挑取酵母菌落，采用高温煮沸和液氮冷却的方法破除酵母细胞壁，具体的操作步骤为：挑取四缺板上成功生长的酵母阳性单菌落，加入10uL0.9％NaCl重悬起单菌落，将离心管放在沸水中煮沸5min，液氮冷却2min，如此重复一次，加入pPR3-N质粒的通用引物以及PCR MIX缓冲液进行菌落PCR验证，对于PCR验证没有条带的菌落抽提质粒进行测序；

步骤四、酵母质粒提取；

步骤五、酵母质粒的扩繁。

2.一种如权利要求1所述的基于酵母双杂交技术筛选膜蛋白互作蛋白的方法，其特征在于，步骤一中诱载体具体为：

pBT3-N上游的序列如SEQUENCE ID.NO.3所示，下游的序列如SEQUENCE ID.NO.4所示；

pBT3-SUC上游的序列如SEQUENCE ID.NO.5所示，下游的序列如SEQUENCE ID.NO.6所示；

pBT3-STE上游的序列如SEQUENCE ID.NO.7所示，下游的序列如SEQUENCE ID.NO.8所示。

3.一种如权利要求1所述的基于酵母双杂交技术筛选膜蛋白互作蛋白的方法，其特征在于，步骤二中自激活检测及诱饵载体功能验证的具体步骤包括：

1)制备酵母感受态细胞；

2)准备变性的ssDNA；

3)构建四种质粒组合，分别为：组合一为1.5μg的质粒Bait与1.5μg的质粒pOst1-NubI，反应组合二为1.5μg的质粒Bait与1.5μg的质粒pPR3-N，反应组合三为1.5μg的质粒pTSU2-APP与1.5μg的质粒pNubG-Fe65，反应组合四为1.5μg的质粒pTSU2-APP与1.5μg的质粒pPR3-N，将四组质粒组合分别加入感受态中，再分别依次加入10uL的ssDNA，600uL的PEG/LiAcmix，涡旋震荡混匀，进行四组反应组合实验；

4)对四组反应组合实验进行结果分析。

4.一种如权利要求1所述的基于酵母双杂交技术筛选膜蛋白互作蛋白的方法，其特征在于，步骤三中感受态细胞的制备步骤包括：

1)将步骤二中验证后的诱饵载体转化NMY51菌株，涂布在培养基板上；

2)将步骤二中的酵母单克隆在液体培养基中进行摇床培养，获得菌液；

3)取1mL摇床培养好的菌液进行离心操作，弃掉上清，用1mL ddH₂O重悬，取600-700uL在酶标仪中测定OD₆₀₀值；

4)以26/OD₆₀₀的值取一定的菌液，离心操作，弃掉培养基，用10mL 2×YPDA培养基重悬，转移到1L锥形瓶中，用40mL 2×YPDA培养基冲洗离心管，再加150mL 2×YPDA到1L锥形瓶中，终体积为200mL；

5)30℃230rpm摇床培养4h左右，使得最终OD₆₀₀值达到0.4-0.7左右。