[发明专利]肺癌相关蛋白1单克隆抗体的制备以及纯化方法

说明书

本发明涉及蛋白质工程领域，具体涉及一种肺癌相关蛋白1单克隆抗体、其制备方法及纯化方法，所述制备和纯化方法包括：免疫小鼠制备肺癌相关蛋白1单克隆抗体小鼠腹水；采用饱和硫酸铵盐析、亲和层析两步法纯化抗体；抗体保存。采用本发明制备和纯化方法得到的肺癌相关蛋白1单克隆抗体纯度经SDS‑PAGE鉴定达到99％。本发明提供一种肺癌相关蛋白1单克隆抗体的制备及纯化工艺。本发明制得的肺癌相关蛋白1单克隆抗体为液体状态，2‑8℃可长期保存，在室温下可保存两年。

技术领域

本发明涉及蛋白质工程领域，具体涉及肺癌相关蛋白1单克隆抗体的制备方案以及纯化工艺。

背景技术

肺癌相关蛋白1(Overexpressed In Lung Cancer,OLC1)是一种新的肿瘤相关基因编码的蛋白，全长334个氨基酸，其Genbank ID：9798。生物信息学分析发现，肺癌相关蛋白OLC1可以在报告基因水平激活NF-kB通路。在肺鳞癌发生的早期阶段(不典型增生和原位癌)，OLC1的表达量升高，提示其可能与肺癌的早期癌变关系密切。最近有研究表明，OLC1在多种人类恶性肿瘤，如鼻咽癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、结直肠癌和食管癌中均高表达。

目前生产大量单克隆抗体的常用方法有小鼠腹水制备、大瓶培养和中空纤维反应器三种，前者多用于实验室制备，后两者适用于工厂化生产。腹水制备方法成本低、易纯化，纯化后抗体浓度高。大瓶培养获得的上清体积大，但抗体浓度低，培养成本和抗体纯化成本均较高。相对于大瓶培养，利用中空纤维反应器进行单克隆抗体生产是比较经济的方法，但设备装置的费用投入较大。

目前市面上没有肺癌相关蛋白1的相关体外诊断用检测试剂盒。对于试剂盒来说，高纯度、高效价的抗体的制备以及纯化是试剂盒研发成功的核心要素，该发明得到的单克隆抗体为以后肺癌相关蛋白1检测试剂盒的研发提供了基础。

发明内容

本发明提供了一种抗肺癌相关蛋白1单克隆抗体、杂交瘤细胞株及其制备方法，所述抗体具有高度特异性，用于特异性识别肺癌相关蛋白1。

一种分泌抗肺癌相关蛋白1单克隆抗体的杂交瘤细胞株，编号为OLC1-38和OLC1-15。

本发明提供了一种所述杂交瘤细胞株的制备方法，其步骤包括：

(1)用肺癌相关蛋白1全长抗原免疫5～6周龄的Balb/c小鼠；

(2)收集免疫小鼠的脾细胞，并与Sp2/0骨髓瘤细胞进行融合，融合的杂交瘤细胞用含次黄嘌呤、甲氨喋呤和胸腺嘧啶核苷的甲基纤维素半固体选择性培养基进行选择性培养；

(3)采用蛋白免疫印记法(Western Blot)鉴定筛选阳性杂交瘤细胞株。

作为进一步的优选，步骤(1)所述免疫包括：将肺癌相关蛋白1全长抗原与等体积的弗氏完全佐剂充分混合乳化，之后采用弗氏不完全佐剂乳化抗原，充分混合至油包水状态后对5～6周龄雌性Balb/c小鼠进行皮下多点免疫，2～3次加强免疫。

作为进一步的优选，所述融合包括：无菌条件下取小鼠脾脏制成细胞悬液，在聚乙二醇介导下融合小鼠脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞，融合后加IMDM细胞培养基终止。

作为进一步的优选，所述小鼠脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞的个数比为5:1～10:1。

作为进一步的优选，所述含次黄嘌呤、甲氨喋呤和胸腺嘧啶核苷的甲基纤维素半固体选择性培养基中包括：含质量浓度为1.25％的甲基纤维素、体积浓度为25％胎牛血清和2％HAT的IMDM培养基。

作为进一步的优选，所述筛选包括：运用蛋白免疫印记法(Western Blot)，以转染肺癌相关蛋白1基因的H1299细胞蛋白为抗原，以转染空载体的H1299细胞蛋白为对照，以抗肺癌相关蛋白1单克隆抗体为待检样品，筛选阳性杂交瘤细胞株。