[发明专利]一种快速检测马立克氏病病毒的RPA引物对、探针、试剂盒及检测方法

说明书

本发明提供一种快速检测马立克氏病病毒的RPA引物对、探针、试剂盒及检测方法，属于分子生物学检测技术领域。本发明RPA引物对序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示；RPA探针序列如SEQ ID No.3所示。本发明检测方法能在39℃条件下20分钟内完成检测，具有快速、灵敏、操作简便、适用于实验室及现场快速检测的特点，为MDV快速诊断及防控提供了技术参考。

技术领域

本发明涉及一种快速检测马立克氏病病毒的RPA引物对、探针、试剂盒及检测方法，属于分子生物学检测技术领域。

背景技术

马立克氏病病毒(Marek`s Disease Virus，MDV)又称神经淋巴瘤病，属于疱疹病毒科，α疱疹病毒亚科，马立克病毒属，可以引起马立克氏病(Marek`s Disease)，会发生淋巴增殖性疾病，主要感染鸡、火鸡、山鸡和鹌鹑等禽类动物。在临床上，以内脏器官、外周神经、性腺、虹膜、肌肉和皮肤单独或多发的淋巴样细胞浸润为特征，感染的马立克氏病的病鸡可能出现的表观症状为瘫痪或者严重的甚至死亡。该病的病毒大量存在羽毛囊上皮细胞中，所以可以通过检测羽毛毛髓进行病毒检测。近年来，毒力较强的MDV病毒株引起的MD发病率呈上升趋势，致病性增强。预防MD主要靠活疫苗，一旦注射便终身带毒，还可能和其他的病毒进行交叉感染，疫苗在生理和环境的压力下容易进行变异，所以防控极其困难。因此需要一种及时、准确的检测技术，对该病的防控具有十分重要的意义。

目前，诊断马立克氏病的实验方法有病原分离法、PCR法，包括普通PCR方法和荧光定量PCR方法、间接免疫荧光法、琼脂扩散试验法(AGP)和ELISA方法，还有最近发展的环介导等温扩增方法(LAMP)。其中，PCR方法因其简便快捷而被广泛使用的检测方法，目前构建的PCR检测方法单独利用强弱毒株存在序列差异的132bp重复序列。传统诊断MD的方法依赖于AGP法检测病鸡羽髓样本和病理组织学切片观察大小不一的淋巴样瘤细胞浸润，操作时间过长且灵敏度较低。LAMP方法是一种等温扩增利用多条引物的方法，但引物设计麻烦且假阳性率高。

重组酶聚合酶扩增(Recombinase polymerase amplification RPA)是近年来发展起来的一种快速诊断不同病原的方法，已广泛用于病毒、细菌、寄生虫诊断中。RPA利用重组酶蛋白与引物形成复合物；该复合物促进引物与双链DNA的同源靶序列的结合，聚合酶进行后续的合成，整个过程仅需在37-42℃下反应20-30分钟即可。与普通PCR方法与荧光定量PCR方法相比，整个过程不需要高温变性和低温退火步骤，操作简单，不需要昂贵的仪器。与传统的MDV诊断方法：琼脂扩散实验(AGP)和间接ELISA方法相比，具有反应时间快的优点。RPA引物比一般PCR引物长，通常需要达到30-35个碱基，扩增产物在300bp以内。目前国内外尚无采用实时荧光RPA检测MDV的报道。

发明内容

有鉴于此，本发明提供一种快速检测马立克氏病病毒的RPA引物对、荧光探针、检测试剂盒及建立了快速检测马立克氏病病毒的方法，本发明方法能在39℃条件下20分钟左右完成检测，具有快速、灵敏、操作简便、适用于实验室及现场快速检测的特点，为MDV快速诊断及防控提供了技术参考。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

一种快速检测马立克氏病病毒的RPA引物对，所述RPA引物对上、下游引物序列分别如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示：

F:5′-TTGTCTACATAGTMCGTCTGCTYCCTGCGTC-3′(SEQ ID No.1)；

R:5′-AAAGGAAAAGTCACGACATCCCCAACAGCC-3′(SEQ ID No.2)。

其中M表示兼并碱基A或C；Y表示兼并碱基C或T。

一种快速检测马立克氏病病毒的RPA荧光探针，其序列如SEQ ID No.3所示：