[发明专利]用于樱桃物种鉴定的特异性DNA区段和引物

说明书

本发明公开了一种用于樱桃物种鉴定的特异性DNA区段、引物和探针。所述DNA区段的基因序列如序列表SEQ ID NO：1所示，所述PCR引物为C36‑F、C36‑R，所述荧光定量PCR和数字PCR引物和探针为C36‑QF、C36‑QR、C36‑QP，核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示。本发明利用了定性PCR技术、实时荧光PCR技术以及数字PCR技术，建立一套樱桃物种特异性定性及定量的检测方法，并对樱桃纯果汁及含樱桃等多种不同水果混合果汁，建立了较为精准的樱桃物种定性和定量的检测方法。

技术领域

本发明涉及分子生物学物种鉴定技术领域，具体涉及用于樱桃物种鉴定的特异性DNA区段和引物。

背景技术

2017年10月Shirasawa,Kenta等人应用下一代测序技术，确定了甜樱桃(Prunusavium)的基因组序列。组装序列总长度为272.4Mb，其中支架序列10148个，N50长度为219.6kb。此项成果已发表在《DNA RESEARCH》上发表。

樱桃作为“早春第一果”、“百果第一枝”具有较高的营养价值和药用价值，而国内外还没有关于樱桃物种源性成分的研究，所以建立樱桃物种特异性的检测方法有利于国家标准的完善。

发明内容

本发明旨在解决上述问题，提供用于樱桃物种鉴定的特异性DNA区段和引物及探针。

用于樱桃物种鉴定的特异性DNA区段，所述DNA区段的基因序列如序列表SEQ IDNO：1所示。

用于樱桃物种特异性鉴定的PCR引物，所述引物为C36-F、C36-R，核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示。

用于樱桃物种鉴定的荧光定量PCR和数字PCR的引物和探针，所述引物为C36-QF、C36-QR，探针为C36-QP，核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示。

一种定性鉴定樱桃物种的试剂盒，包含上述引物C36-F、C36-R。

一种定量鉴定樱桃物种的试剂盒，包含上述引物C36-QF、C36-QR和探针C36-QP。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本发明利用Perl语言编程和NCBI-BLAST从多种水果基因组中筛选获得了1条樱桃物种特异性序列，利用普通PCR通用体系和程序验证并测序，得到了完整的序列。建立了樱桃物种特异性定性PCR鉴定方法，C36-F/R在引物浓度为0.4μmol/L、退火温度为58℃时灵敏度可达0.5％。此方法可用于混合鲜榨果汁中樱桃成分定性鉴定。建立了樱桃物种特异性实时荧光PCR方法，C36-QF/QR/QP在引物浓度和探针浓度均为0.5μmol/L时，灵敏度达0.1％。扩增条件经优化后，建立了Ct值与樱桃DNA的质量之间的量化关系方程式y＝-3.356x+31.062，R²＝0.998，扩增效率为98.545％。此方法可用于定量鉴别混合鲜榨果汁、非浓缩果汁中樱桃成分鉴定，并得能得到樱桃模板DNA含量。建立了樱桃物种特异性数字PCR方法，C36-QF/QR/QP在引物浓度为0.5μmol/L，探针浓度为0.2μmol/L，退火温度为56.7℃时扩增效果最佳。确定线性定量范围下限为0.24ng，拷贝数和DNA模板量之间具有y＝7.4093x+1.2482的线性关系，且相关系数R²＝1，检测拷贝数下限约为1.8copy/μL。此方法可用于定量鉴别混合鲜榨果汁、非浓缩果汁和浓缩果汁中樱桃成分鉴定，并能得到樱桃的目标DNA的拷贝数。

附图说明

图1为引物tRNALeu-F/R对水果DNA PCR扩增结果图；