[发明专利]一种利用甘蔗渣生物催化合成木糖醇的方法

权利要求书

1.一种利用甘蔗渣生物催化合成木糖醇的方法，其特征在于主要包括以下步骤：

（1）甘蔗渣的预处理：将甘蔗渣烘干至恒重后粉碎处理并60-80目过筛，备用；在1-3g甘蔗粉末中加入适量液氮处理5-10min，再在研钵中研磨成粉末，然后冷却至室温；将液氮处理好的粉末在烘箱中处理至恒重，加入30-40mL去离子水，在冰水浴条件下超声处理30-40min，功率调节成300-350w，再在真空冷冻装置中处理成粉末；再往粉末中加入10-14wt%的γ-戊内酯和5-15mL的1,3-二甲基咪唑磷酸二甲酯，将三种物质共同加入50mL三颈烧瓶中，在温度90-130℃下且在400-500rpm下搅拌反应1-3h；反应结束后，真空抽滤、洗涤和烘干，备用，

（2）蒸汽爆破处理：将预处理后的甘蔗渣与15-60mL蒸馏水混和，固液比为1：15-1:20，倒入蒸汽爆破系统，设置压力为1.0-1.2MPa，维压时间为10-15min，过滤得到爆破液和爆破渣，爆破液保留，爆破渣使用去离子水和无水乙醇洗净后烘干至恒重，

（3）碱处理：取30-40mL的10%（wt%）的NaOH溶液与爆破处理的甘蔗渣混和，在60-65℃水浴中搅拌处理，在250-300rpm下搅拌处理30-40min；处理结束后，利用浓HCl调节pH值至5.0-5.5，

（4）纤维素酶酶解处理：将上述处理液混入0.3-0.5g的纤维素酶，30-35℃水浴，250-300rpm搅拌反应1-2h；

（5）乙醇提取半纤维素：将上述处理液于60-65℃下浓缩体积至原体积的1/3-1/2，结束后用3倍体积的无水乙醇充分震荡反应，震荡结束后，真空抽滤，用去离子水冲洗，

（6）木聚糖酶酶解处理：将上述滤渣与30-40mL去离子水混和，调节pH=5.0-6.0，加入0.3-0.5g木聚糖酶，50-60℃水浴，250-300rpm搅拌反应2-3h，得到的水解液备用，

（7）制备浓缩液：将爆破液和水解液混和，60-70℃水浴浓缩至原料液体积的1/3-1/4，使用对一溴苯胺定糖法测定木糖浓度，备用，

（8）浓缩液中和：将浓缩液使用NaOH调节pH值至6.5-7.5，

（9）基因工程菌的培养和富集：将构建好的含有木糖还原酶基因的大肠杆菌BL21（DE3）甘油保菌在含50μg/mL的LB固体培养基进行划线接种，37℃培养过夜，基因来源：莫格假丝酵母来源的木糖还原酶；将得到的单菌落挑取1-2个转接到50mL含50μg/mL的LB液体培养基中，重复转接多个，37℃，200rpm震荡培养至OD₆₀₀=0.6～0.8，加入50μL 0.5mol/L的IPTG至培养基终浓度为0.5mmol/L，25℃，200rpm震荡诱导培养过夜；诱导结束后在8000rpm转速下离心5min，弃去上清液，收集菌体备用，再用pH=7.2-7.4的PBS缓冲液重悬菌体，8000rpm转速离心5min，再重复清洗，最终收集湿菌体，

（10）全细胞催化合成木糖醇：称取2-3g湿菌体与20-30mL中和后的浓缩液混和，将菌体打散，再加入50μL0.5mol/L的NADPH，置于50mL三颈烧瓶中，置于30-35℃水浴中，400-500rpm搅拌反应3-4h。