[发明专利]扩增子测序用引物的设计及扩增子测序文库的构建方法

说明书

本发明提供扩增子测序用引物的设计及扩增子测序文库的构建方法。引物设计流程主要基于Primer3软件进行设计，利用本发明提供的扩增子测序用引物的设计方法，对于距离正常的靶位点和距离非正常的靶位点分别进行不同的处理设计，减少非特异性扩增，设计出的引物具有特异性较强的性质。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地说，涉及扩增子测序用引物的设计及扩增子测序文库的构建方法。

背景技术

扩增子测序是一种高靶向性的目标区域测序方法，利用设计的引物序列靶向地捕获目标区域，然后进行高通量测序(NGS)，分析测序结果，得到相应信息。扩增子测序由于自主地引物设计使得扩增反应高度灵活，目前已经成为基因测序领域的热门选择。因此成功设计出引物是决定扩增子测序实验成功与否的关键，是实验的前提条件和重要流程。现有的扩增子测序引物设计方法对于引物设计细节描述不清，缺少针对特殊位点的有效设计方法，且可设计的扩增子重数相对较少。本发明对特殊位点提供处理方法，同时提供超高重扩增子引物panel筛选方法。能够高效针对所需的位点进行引物设计，引物重数高，非特异性扩增及引物二聚体少，克服了现有引物设计方法的缺陷。

发明内容

本发明的目的是提供扩增子测序用引物的设计方法。

本发明的另一目的是提供扩增子测序文库的构建方法。

为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种扩增子测序用引物的设计方法，基于Primer3软件进行引物设计，所述方法包括以下步骤：

A、用户准备如下文件：参考基因组序列文件(Reference.fa)、SNP位点物理位置文件和物种各条染色体长度信息文件；

B、运行Primer3软件生成参考基因组索引文件(reference.fa.myfasteridx)，按照用户指定长度从参考基因组上获取SNP位点侧翼序列；

C、根据两个SNP位点之间的距离，分成以下三种情况进行处理：

处理1：若两个SNP位点间距离≥ND(Normal Distance)，软件执行用户输入的引物设计相关参数，调用primer3_core，将此类型SNP位点的引物设计结果写入文件Primer3_output.txt；

处理2：若存在临近位点，两个SNP位点间距离＜CD(Close Distance)，多个SNP中两端SNP间的距离＜BD(Bad Distance)，则将这些SNP位点所在区段作为靶标区域，按照用户输入的引物设计相关参数，调用primer3_core；并将结果继续写入文件Primer3_output.txt；

处理3：若两个SNP位点间距离＜CD(Close Distance)，多个SNP中两端SNP间的距离＞BD(Bad Distance)，软件生成此类SNP所在区段的侧翼序列文件sequences_badsites.fa；根据fasta序列标题行提供的SNP位点在序列中的相对位置，用户根据其相对位置对多个SNP位点进行取舍，自行制定参数，用软件Primer3针对每组SNP位点进行引物设计；

D、按照如下原则设计特异性多重PCR引物：

d1.引物序列与基因组进行比对：筛选比对到参考基因组唯一位置上的引物；

d2.引物间的比对：保留彼此间不会形成引物二聚体的引物；

d3.扩增产物大小为180-400bp；

对满足上述d1～d3的引物进行人工校正，即得扩增子测序用引物。

本发明中，ND表示2倍指定侧翼序列长度，CD表示不放在一条序列上进行引物设计的两个SNP位点间距值，BD表示同一序列上间距最远的两个SNP位点间距值。