[发明专利]白葡萄球菌粉及其应用

权利要求书

1.一种白葡萄球菌粉，其特征是包括如下步骤：

步骤1）菌种的制备：

（1）菌种：白色葡萄球菌，菌种为上白71-1，长白75-1或湘白72-1，任选1-2株，由武汉生物制品研究所提供；

菌落：在营养琼脂培养基上呈乳白色集落，边缘整齐，不透明，不产生色素；

菌型：应系革兰氏阳性，呈葡萄状不规则排列的球菌；

（2）菌种保存：

冷冻真空干燥保存法，保存温度0-4℃，保存时间3-5年；液体石蜡保存法，保存温度0-4℃，保存时间6个月；定期移植保存法，保存温度0-4℃，保存时间1个月；

（3）菌种的选育：

菌种在使用过程中，出现衰老、退化和变异现象时,采用纯种分离法及时对菌种进行选育、复壮，挑选比较理想的菌种供生产使用；

（4）培养基的制备：

营养琼脂培养基的制备：

胨10g，氯化钠5g，葡萄糖1g，肉浸液1000ml，琼脂15-20g；

取胨和氯化钠加入肉浸液内，微温溶解后，加入15-20g琼脂煮沸，加入葡萄糖溶解，调节PH值使灭菌后为7.2±0.2，分装，121℃灭菌20分钟，冷后制成斜面；

营养肉汤培养基的制备：

胨10g，氯化钠5g，葡萄糖1g，肉浸液1000ml；

取胨、氯化钠和葡萄糖加入肉浸液内，微温溶解，调节PH值使灭菌后为7.2±0.2，分装，121℃灭菌20分钟，冷后备用；

（5）菌种的制备：

按无菌要求，把冻干管内的菌种传至若干试管斜面，在37±1℃培养18-24小时，冷藏保存，把试管斜面的菌种传若干扁瓶斜面，在37±1℃培养8-10小时，用营养肉汤培养基或生理盐水制成均匀的菌悬液供生产使用，在传扁瓶斜面的同时可传若干试管斜面，培养后保存，并填好菌种传代记录；

步骤2）基础液消化：

（1）基础液的用量：玉米浆450kg和水900kg(或玉米水1600kg)；

（2）基础液消化：将玉米浆和水（或玉米水）用打料泵打入消化罐内，夹层升温至50-60℃时，用NaOH调PH值至8.0-8.5，罐内通汽继续升温至100℃，保温1小时，至少放置10小时，冷水降温至50℃以下，过滤前用盐酸调PH值至6.0-6.5，用压滤机过滤备用；

步骤3）培养基配制：

（1）补料瓶内补料液各成份的配比、用量及配制：

40%葡萄糖、20%氢氧化钠和10%有机硅消泡剂准确称量后，充分溶解，分别倒入补料瓶内，用水补加至全量，包扎后灭菌；

（2）补料罐内补料液各成份的配比、用量及配制：

40%葡萄糖、20%氢氧化钠和10%有机硅消泡剂准确称量后，分别在化糖罐、化碱罐和配料桶内充分溶解后，用水补至所需体积，用真空泵分别抽入各补料罐内，进行实罐灭菌，也可根据实际用量，按照配比进行配制；

（3）培养基配制：

（3．1）种子罐培养基的配比、用量及配制：

将玉米浆（或玉米水）消化液打入种子罐内，加入各物料，用水补至全量，搅拌充分溶解后，用氢氧化钠调PH值至7.4-7.6后，灭菌；

（3．2）发酵罐培养基的配比、用量及配制：

将玉米浆（或玉米水）消化液打入配料罐内，加入各物料，用水补至规定体积，搅拌充分溶解后，用氢氧化钠调PH值至7.4-7.6后，用打料泵将配制后的培养基打入发酵罐内，灭菌；

步骤4）灭菌：

（1）补料瓶内补料液及所需物品的灭菌：

把补料瓶与外界连接口用纱布、防潮纸包扎以后，放入小型手控灭菌器内，把备用的种子瓶，多枝管道用同法包扎后，同时进行灭菌；灭菌压力为0.11-0.12MPa，温度为121-125℃，保温45分钟40%葡萄糖液要单独灭菌，灭菌压力为0.09-0.11MPa，温度为110-121℃，保温30分钟；

（2）空罐灭菌：

初用罐、间断使用罐或出现染菌需进行空罐灭菌处理；首先预温罐体，夹层升温至90℃，开启罐内和罐底进汽阀，让蒸汽在罐内流通20分钟后，关小排汽阀，待压力升至0.11-0.12MPa，温度为121-125℃，保温45分钟，灭菌结束后，开启排汽阀，待罐内压力降至为零时，方可打开罐盖；

（3）实罐灭菌：

（3．1）培养基灭菌：

关紧罐盖，夹层升温预热到90℃，开启罐内进汽阀，待罐内压力升到0.05MPa时，关小排汽阀，压力升至0.11-0.12MPa，温度为121-125℃，保温30分钟；培养基灭菌后，关闭各进汽阀（种子罐在火焰保护下接已灭菌的多枝管道）；然后开启排汽阀，待罐内压力降至0.02-0.03MPa时，开启压缩空气阀门，同时降温冷却到37±1℃备用；

（3．2）补料液灭菌：

开启补料罐蒸汽阀门，夹层升温，压力升至0.05MPa时，关小排汽阀，使罐内压力升至0.11-0.12MPa，温度121-125℃，保温45分钟；40%的葡萄糖补料液的灭菌压力为0.09-0.11MPa，温度为110-121℃，保温30分钟；灭菌完毕后，关闭各进汽阀，开启排汽阀和降温阀，当压力降至0.02-0.03MPa，通入除菌空气，并降温至37±1℃备用；

（4）除菌过滤器灭菌：

实罐灭菌的同时，开启除菌过滤器的蒸汽阀门，使蒸汽充分流通，压力0.15-0.20MPa，保压30分钟，然后通入压缩空气吹干30分钟以上备用；另外除菌过滤器的过滤纸每周检查更换一次；

步骤5）培养：

（1）下种、移种：

种子罐内温度降至37℃时，将准备好的种子以无菌手续接入种子罐内培养，待菌体生长进入对数生长期，并达到一定浓度（一般200亿/ml）时，取种并移入发酵罐内继续培养（移种管道在移种前30-40分钟灭菌好备用）；

（2）培养：

培养过程中，随时观察温度、通气量和罐内泡沫，培养时通气量应保持在0.05-0.08MPa，温度应保持在36-38℃之间，PH值每次调整后为7.2-7.4之间，在菌体的对数生长期时，通气量要相应增大；

（3）取样：

下种、移种前以无菌手续（将取样口通蒸汽灭菌15-20分钟）取样，检测培养基的PH值、浓度、吸收度值、镜检，以及做无菌检验；斜面下种4小时，开始取样检测，大瓶菌种下种2小时开始取样检测，发酵罐移种后2小时开始取样检测，检测PH值、浓度、菌型、吸收度值，每次取样操作人员与化验人员一起操作，由化验员检测各项目，将化验结果及时通知操作人员；操作人员在菌体大量生长繁殖时要每半小时检测并调整PH值；

（4）补料：

培养过程中，如泡沫过多可酌情加入消泡剂，根据检测的PH值浓度，补加灭菌后氢氧化钠溶液，使调整后的PH值在7.2-7.4之间，同时补加适量的葡萄糖溶液；

步骤6）灭活：

菌体大量生长繁殖后，若2-3小时内浓度不再明显上升，PH值和吸收度值基本不变的情况下，经检测合格，按0.6%的比例加入甲醛溶液，搅拌5-10分钟,静止2小时，彻底灭活后，通知沉淀操作人员沉淀分离；

步骤7）絮凝剂的配制：

（1）溶解：

加水780kg，夹层升温至40-60℃，加入聚丙烯酰胺150kg，搅拌10-14小时溶解；

（2）变性处理：

溶解后，加二甲胺28.8kg，甲醛15kg，搅拌4-6小时；

（3）酸化：

变性处理后，用硫酸调PH值3.8-4.1，搅拌1小时后使用；

步骤8）沉淀、干燥：

将灭活后的发酵液压入沉淀罐，用硫酸调PH值6.0-6.5之间，按1.5-2.5%的比例加入絮凝剂，充分搅拌混合后静置30分钟，分离；将菌泥均匀放置烘盘内，厚度不超过5cm，85-95℃干燥30-60分钟，使干燥失重≤6.0%；

步骤9）粉碎：

将干燥后的菌块，先通过10目筛粗粉碎成小颗粒，再细粉碎，细粉碎后的菌粉应通过100目筛；

步骤10）混合：

将菌粉置混合机中，运转8分钟，将菌粉放入料桶内，最后混合均质的菌粉为一批；

步骤11）包装：

将检验合格的菌粉按20kg/桶包装，内为双层塑料袋，外为纸桶，桶内放装箱单，桶外贴标签，桶内外品名、批号、数量应一致，要认真核对，检验合格后入库。

2.根据权利要求1所述的白葡萄球菌粉在制备镇咳药物中的应用。