[发明专利]一种高效低毒四霉素B衍生物及其定向高产代谢工程方法

权利要求书

1.一种高效低毒四霉素B衍生物，分子式为C₃₅H₅₅NO₁₂，化学结构式为：

2.一种根据权利要求1所述的高效低毒四霉素B衍生物高产的代谢工程方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

S1、在菌株刺孢吸水链霉菌北京变种CGMCC4.1123中对制霉菌素生物合成基因簇中聚酮合酶基因nysI进行同框缺失，获得基因nysI同框缺失突变菌株；

S2、在所述同框缺失突变菌株中对四霉素生物合成基因簇中P450单加氧酶基因tetrG进行失活，获得基因tetrG失活突变菌株；

S3、在所述基因tetrG失活突变菌株中通过加强聚酮链延伸单元前体丙二酰辅酶A的供给与四霉素生物合成基因簇后修饰基因tetrK和tetrF的表达，获得高产所述四霉素B衍生物的突变菌株；

S4、发酵培养所述高产四霉素B衍生物的突变菌株，获得所述高效低毒四霉素B衍生物；

步骤S2具体包括如下步骤：

S21、构建用于四霉素生物合成基因簇中P450单加氧酶基因tetrG失活质粒pJQK513；

S22、将所述质粒pJQK513通过链霉菌与大肠杆菌属间接合转移失活所述基因nysI同框缺失突变菌株中P450单加氧酶基因tetrG；

S23、通过对步骤S22获得的突变菌株所提基因组DNA进行PCR验证获得四霉素生物合成基因簇中P450单加氧酶基因tetrG失活突变菌株；

步骤S3包括如下步骤：

S31、构建用于异源表达acc基因及加强四霉素生物合成基因簇后修饰基因tetrK和tetrF表达整合型质粒pJQK512；

S32、通过链霉菌与大肠杆菌属间接合转移将质粒pJQK512整合至所述基因tetrG失活突变菌株的染色体上，获得高产所述四霉素B衍生物的突变菌株；

步骤S4中，所述发酵培养是将所述高产四霉素B衍生物的突变菌株的孢子悬浮液接种于TBSY种子培养基中，220rpm，30℃培养24h后以5％的比例转接至发酵培养基，继续以220rpm，30℃条件培养120h，得发酵培养液。

3.根据权利要求2所述的高效低毒四霉素B衍生物高产的代谢工程方法，其特征在于，步骤S31中，所述acc基因来源于天蓝色链霉菌M152，由accA2、accB与accE三个基因组成，其中accB与accE基因在天蓝色链霉菌M152中共用一个启动子；其中，accA2基因序列如SEQ IDNO.40所示；accB基因序列如SEQ ID NO.41所示；accE基因序列如SEQ ID NO.42所示。

4.根据权利要求3所述的高效低毒四霉素B衍生物高产的代谢工程方法，其特征在于，异源表达acc基因是通过将accA2与accBE基因分别置于强启动子PermE*下实现的。

5.根据权利要求2所述的高效低毒四霉素B衍生物高产的代谢工程方法，其特征在于，步骤S31中，所述后修饰基因tetrK基因序列如SEQ ID NO.43所示。

6.根据权利要求2所述的高效低毒四霉素B衍生物高产的代谢工程方法，其特征在于，步骤S31中，所述后修饰基因tetrF基因序列如SEQ ID NO.44所示。

7.根据权利要求2所述的高效低毒四霉素B衍生物高产的代谢工程方法，其特征在于，步骤S31中，加强四霉素生物合成基因簇后修饰基因tetrK和tetrF是通过将tetrK和tetrF基因均置于强启动子KasOp*下实现的。

8.一种如权利要求1所述的高效低毒四霉素B衍生物的产生菌株，所述菌株为刺孢吸水链霉菌北京变种(Streptomyces hygrospinosus var.beijingnsis)SY05，保藏编号为CGMCC NO.18370。