[发明专利]一种高危人乳头瘤病毒分型检测方法与试剂盒

权利要求书

1.一种高危人乳头瘤病毒基因分型检测方法与试剂盒，其特征在于，采用人乳头瘤病毒通用引物SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ IDNo.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8以及SEQ ID No.9，和人乳头瘤病毒33、35、45、51、56、66型特异性TaqMan探针SEQ ID No.16、SEQ ID No.17、SEQ ID No.18、SEQ ID No.19、SEQ IDNo.20和SEQ ID No.21，以及在上述TaqMan探针互补序列基础上设计且与探针序列不完全配对的PCO探针SEQ ID No.22、SEQ ID No.23、SEQ ID No.24、SEQ ID No.25和SEQ IDNo.26，要求TaqMan探针和PCO探针标记相同荧光发光基团、TaqMan探针3’端标记荧光淬灭基团、PCO探针3’端进行封闭标记，通过荧光PCR扩增技术结合单波长熔解曲线分析技术在单管反应中实现人乳头瘤病毒33、35、45、51、56、66型核酸分型检测。

2.如权利要求1所述的方法与试剂盒，其特征在于，所用人乳头瘤病毒33、35、45、51、56、66型检测靶序列为SEQ ID No.10、SEQ ID No.11、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ IDNo.14、SEQ ID No.15，设计的通用引物SEQ ID No.1～SEQ ID No.9能扩增SEQ ID No. 10～SEQ ID No. 15靶序列连续130～180个核苷酸，根据序列优化设计后的引物能扩增其连续90～98个核苷酸。

3.如权利要求1所述的方法与试剂盒，其特征在于，分别基于SEQ ID No.10～SEQIDNo.15靶序列设计的型特异性TaqMan探针SEQ ID No.16～SEQ ID No.21，长度为24～35个核苷酸， 5’端均标记相同的荧光发光基团、3’端标记荧光淬灭基团。

4.如权利要求1所述的方法与试剂盒，其特征在于，根据SEQ ID No.16、SEQ ID No.17、SEQ ID No.18、SEQ ID No.19、SEQ ID No.20和SEQ ID No.21探针的互补序列，设计3～6个碱基的错配或者不互补，优化设计出PCO探针SEQ ID No.22、SEQ ID No.23、SEQ ID No.24、SEQ ID No.25和SEQ ID No.26，3’端标记PHO或BHQ。

5.如权利要求1所述的方法与试剂盒，其特征在于，试剂盒所用的人乳头瘤病毒分型通用引物序列可以为和SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ IDNo.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8以及SEQ ID No.9同源性大于85％以上的序列，TaqMan荧光探针可以为SEQ ID No.16、SEQ ID No.17、SEQ ID No.18、SEQ ID No.19、SEQ ID No.20和SEQ ID No.21同源性大于85％以上序列，探针5’端标记FAM荧光基团，3’端标记BHQ2淬灭基团。

6.如权利要求1所述的方法与试剂盒，其特征在于，引入了一个内参照系统用于避免检测结果假阴性，内参照系统包括内参引物SEQ ID No.27和SEQ ID No.28、内参探针SEQ IDNo.29，其中探针SEQ ID No.29 5’端标记CY5荧光基团、3’端标记BHQ2淬灭基团，内参探针也可以是和SEQ ID No.29序列同源性大于85％以上的序列。

7.如权利要求1所述方法与试剂盒，其特征在于，试剂盒包括PCR缓冲液、引物探针、DNA聚合酶、阴性对照、阳性对照以及临界阳性对照。