[发明专利]利用CRISPR/Cas9系统敲除猪GOT1基因的方法

说明书

本发明涉及生物技术领域，具体涉及利用CRISPR/Cas9系统敲除猪GOT1基因的方法。本发明提供特异性靶向猪GOT1基因的sgRNA、包含该sgRNA的CRISPR/Cas9基因敲除载体、利用该载体进行猪GOT1基因敲除的方法以及猪GOT1基因的检测方法。本发明提供的CRISPR/Cas9敲除载体能够实现较高的猪GOT1基因敲除效率，显著提高了GOT1基因敲除细胞和GOT1基因敲除猪的构建效率，为猪GOT1基因的功能研究及其应用提供了有效方法和基础。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及特异性靶向猪GOT1基因的sgRNA、含有该sgRNA的CRISPR/Cas9基因敲除载体，以及利用该载体进行猪GOT1基因敲除的方法和猪GOT1基因敲除的检测方法。

背景技术

GOT1是一种磷酸吡哆醛(Pyridoxal phosphate,PLP)依赖的转氨酶，在细胞质基质中参与天冬氨酸(Aspartate,Asp)和α-酮戊二酸(α-Ketoglutarate,α-KG)生成谷氨酸(Glutamate,Glu)与草酰乙酸(Oxaloacetate,OAA)的可逆反应，在维持细胞氧化还原平衡、促进肿瘤细胞增殖、调节氨基酸代谢方面具有重要作用。

目前，GOT1基因的研究主要集中在小鼠中，在猪等哺乳动物的研究比较少。通过利用CRISPR/Cas9系统敲除猪GOT1基因，在体外和体内研究猪GOT1基因的功能，对于研究GOT1基因在猪发育过程中的功能及其发挥作用的机制具有重要意义。

CRISPR/Cas9是细菌和古细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御，可用来对抗入侵的病毒及外源DNA。而CRISPR/Cas9基因编辑技术，则是对靶向基因进行特定DNA修饰的技术，这项技术也是目前用于基因编辑的比较前沿的方法。以CRISPR/Cas9为基础的基因编辑技术在一系列疾病(例如血液病、肿瘤和其他遗传疾病)的基因治疗的应用领域都展现出极大的应用前景。开发高效的猪GOT1基因的CRISPR/Cas9系统敲除方法对于提高猪GOT1基因敲除效率和GOT1基因敲除细胞或动物的构建效率具有重要意义。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供利用CRISPR/Cas9系统高效敲除猪GOT1基因的方法以及猪GOT1基因敲除的高效检测方法。

为实现上述目的，本发明的技术方案如下：

第一方面，本发明提供特异性靶向猪GOT1基因的sgRNA，其靶向猪GOT1基因的第517位至第536位的序列。

本发明通过大量筛选发现采用猪GOT1基因上的第517位至第536位的序列作为靶标序列，具有较高的敲除效率。

针对上述猪GOT1基因上的靶标序列，本发明设计了特异的sgRNA，并进一步发现采用如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列对应的sgRNA能够实现较高的打靶效率和GOT1基因敲除效率。

作为优选，所述特异性靶向猪GOT1基因的sgRNA的编码基因的核苷酸序列如SEQID NO.3所示。

SEQ ID NO.3：sgRNA-3：5’-ACATTCGGTCCTATCGCTAT-3’。

第二方面，本发明提供含有所述特异性靶向猪GOT1基因的sgRNA的CRISPR/Cas9基因敲除载体。

作为本发明的优选实施方式，所述CRISPR/Cas9基因敲除载体为连接有所述特异性靶向猪GOT1基因的sgRNA的pHS-CR054载体。

第三方面，本发明还提供所述CRISPR/Cas9基因敲除载体的构建方法，其为：将所述特异性靶向猪GOT1基因的sgRNA与pHS-CR054载体连接，得到所述CRISPR/Cas9基因敲除载体。

作为优选，所述构建方法包括以下步骤：