[发明专利]一种金黄色葡萄球菌肠毒素A纳米抗体A21、应用及试剂盒

说明书

本发明公开了一种金黄色葡萄球菌肠毒素A纳米抗体A21、应用及试剂盒。本发明获得的纳米抗体具有相对分子质量小、稳定性强、产量高、能特异性识别SEA，较常规单克隆抗体用途更广，特异性更强。本发明公布了这种纳米抗体及编码该纳米抗体的基因序列，生产该纳米抗体的方法以及应用了该抗体的试剂盒。本发明获得的纳米抗体可避免与金黄色葡萄球菌表面蛋白A结合，表现出较高特异性，具有稳定性好、分子量小且可大规模生产。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种金黄色葡萄球菌肠毒素A纳米抗体A21、应用及试剂。

背景技术

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，SA)是一种常见的食源性致病菌，由其引起的食品中毒在革兰氏阳性菌中高居首位，其致病能力主要取决于该菌产生的肠毒素(Staphylococcal enterotoxins，SEs)。SEs是由金黄色葡萄球菌分泌产生的可溶性胞外毒素蛋白质，结构相似，分子量为27.5～30kDa，热稳定性好，经100℃煮沸30min而不被破坏，因此，金黄色葡萄球菌污染的食物经过一般加热处理后，虽然细菌菌体可被杀死，但其产生的肠毒素仍然具有活性和致病力。按血清学分类，主要有A、B、Cs、D、E等血清型，其中以SEA引起的食物中毒发病率最高，主要存在于肉类，乳等蛋白质含量较高的动物性食品中，因此，对食品中SEA的检测显得尤为重要。然而，SEA的检测存在两个主要问题：首先食物基质的成分较为复杂，含有多种蛋白质、脂类及其他化合物，这些成分的存在给SEA的准确检测造成了干扰；其次，SA在食物中往往仅产生痕量或微量的SEA(ng/g)这对检测方法的灵敏度提出了较高的要求。在食物基质中实现对肠毒素的定量检测一直是一项具有挑战性的任务。目前，免疫学检测方法因具有快速、特异性强、操作简便、结果易于判断等特点被广泛应用于SEs的快速检测中。其中免疫学检测法因具有操作简单、检测速度快等特点，是SEs例行筛查检测中最常用方法且发展较为成熟的检测方法，其原理为两个识别SEA表面的两个抗原位点的抗体，在SEA存在时形成夹心结构，借助检测抗体上的标记物从而判读检测结果。目前，国内外研究制备的金黄色葡萄球菌及其肠毒素抗体均为识别其表面抗原的多克隆抗体或单克隆抗体，但是传统单克隆抗体的制备耗时耗力且产量低，且葡萄球菌蛋白A(spA)的干扰是对SEs的基于免疫学检测中最重要的问题。SpA是金黄色葡萄球菌在细胞表面展示的蛋白质，也在外部释放，强烈结合哺乳动物产生的所有IgG的Fc端，因此，用于检测金黄色葡萄球菌毒素的抗体会产生假阳性结果，使方法准确性较差，从而影响了应用价值。

纳米抗体技术，是在传统抗体的基础上，运用分子生物学技术研发得到，是目前已知最小的可结合抗原的抗体分子。最初有比利时科学家Hamers.R在骆驼血液中发现，普通的抗体蛋白由两条重链和两条轻链组成，而从骆驼血液中发现的新型抗体天然缺失轻链和重链恒定区1(CH1)的重链抗体，克隆其可变区得到只由一个重链可变区组成的单域抗体，称为单域重链抗体(Variable domain of heavy chain of heavy-chain antibody，VHH)，又称为纳米抗体(nanobody，Nb)。纳米抗体与多克隆抗体和单克隆抗体相比，还具有以下优点：

1)无Fc识别位点，可避免与protein A结合导致的假阳性问题；

2)具有更长的CDR3区，且CDRs区和自身的另一些结构域不存在成对互补关系，故具有更多的柔韧性和凸面性，加之小体积(12～15kD，2×2×4nm)，能其更好的和抗原表面的裂缝和腔隙相结合，从而提高纳米抗体的抗原特异性和亲和力，在纳摩尔至皮摩尔范围内都有很好的亲和力。在相同的检测范围内，单价纳米抗体的亲和力是普通二价抗体的两倍。特别对于表面结构较复杂的细菌或大分子蛋白等，纳米抗体将有利于克服表面结构的位阻效应与表面抗原识别。

3)纳米抗体稳定性高、水溶性好、可在微生物系统中大量合成表达，为纳米抗体低成本、高效率的生产创造了条件。

4)纳米抗体的C端(C-terminus)位于抗原结合位点的相反部位，易于进行定向功能化修饰，进而进行定向修饰。