[发明专利]NTRK融合突变标准品及其制备方法和应用

说明书

本发明涉及一种NTRK融合突变标准品及其制备方法和应用，所述方法包括如下步骤：分析出NTRK融合基因种类与肿瘤之间的关系；设计出NTRK不同融合突变的序列信息；将不同种的NTRK融合序列，稳定整合进该细胞的基因组中；培养细胞并裂解细胞，再提取RNA并检测RNA的浓度和纯度；根据目的序列，设计引物和探针，采用sanger测序和DdPCR验证目标序列的融合，以及对应的拷贝数信息；设计不同的实验组，验证标准品的稳定性和特异性。本发明的NTRK融合突变标准品的制备方法，适用于多用检测手段，具有很好的商业前景和临床前景。

技术领域

本发明涉及一种NTRK融合突变标准品及其制备方法和应用。

背景技术

NTRK基因包含3种(NTRK1、NTRK2、NTRK3)，分别编码3种蛋白TRK1、TRKB、TRKC，属于跨膜激酶蛋白，这些激酶用过配体依赖性起作用，与配体结合后，将胞外信号传递到细胞核，刺激细胞生长，增殖和存活，涉及的通路有MAPK/ERK和PI3K/AKT等。

NTRK基因如果发生融合，配体结合域消失，保留了TRK激酶结构域，NTRK基因如果和管家基因融合后，就变为组成性激活，不依赖配体结合，而具有激酶活性，导致下游通路激活，导致细胞的异常增殖，引导肿瘤发生，因此NTRK融合突变对肿瘤的发生、治疗具有非常大的意义，2018年国外顶尖药企LOXO陆续发布NTRK的抑制剂LOXO-101和LOXO-292，对17种肿瘤有非常好的抑制作用，缓释率达到77％左右，2018年11月FDA加速批准LOXO-101上市，同时NCCN指南更新，NTRK的检测写入2019年NSCLC指南，不管是临床实验还是临床治疗，都要求开展NTRK的检测。

NTRK的检测可以分为IHC、FISH和NGS，其中IHC和FISH都有明显的缺点，NGS是首选，其中基于DNA的检测，涉及内含子大片段复杂，涉及内含子断点复杂，探针难以设计，不能判断是否存在转录产物、蛋白产物等原因，并不适合；基于RNA的检测，断点明确，有明确的转录产物和蛋白，临床意义明确和重要，因此是检测的首选，有迫切的需求。因此临床亟待开发相应的检测手段，亟待对应的标准品来测试检测的灵敏度、特异性和稳定性。

发明内容

本发明的一个目的在于提出一种NTRK融合突变标准品的制备方法。

本发明的一种NTRK融合突变标准品的制备方法，包括如下步骤：S101：分析出NTRK融合基因种类与肿瘤之间的关系；S102：根据分析的结果，设计出NTRK不同融合突变的序列信息；S103：将不同种的NTRK融合序列，通过病毒感染，稳定整合进母细胞的基因组中；S104：培养细胞并裂解细胞，再提取RNA并检测RNA的浓度和纯度；S105：根据目的序列，设计引物和探针，采用sanger测序和DdPCR验证目标序列的融合，以及对应的拷贝数信息；S106：设计不同的实验组，验证标准品的稳定性和特异性。

本发明的NTRK融合突变标准品的制备方法，可根据临床实际任意制备需要的NTRK融合类型；可挑选多种拷贝数的标准品，也可以无限稀释到低频拷贝；适用于多用检测手段，Q-PCR、AMRS-PCR和RNA-seq等；具备与临床病人相同的RNA生物学特点；有效评估临床检测方法学，指导病人入组和用药，具有很好的商业前景和临床前景。

进一步地，在所述步骤S101中，分析NTRK融合基因种类与肿瘤之间的关系时，以临床病人的测序情况为根据。

进一步地，在所述步骤S103中，所述母细胞选择背景清晰的人类细胞株作为母细胞。

本发明的另一个目的在于提出利用权利要求1所述方法制备的NTRK融合突变标准品。

本发明的再一个目的所述的NTRK融合突变标准品在临床医学和保健领域中的应用。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。