[发明专利]一种三联高效氨氮降解微生态制剂及其制备方法

权利要求书

1.一种三联高效氨氮降解微生态制剂，由地衣芽孢杆菌、类球红细菌和乳酸菌按比例混合而成，其特征在于：所述地衣芽孢杆菌和植物乳杆菌的比例为1:1。

2.一种如权利要求1所述的三联高效氨氮降解微生态制剂，其特征在于：所述类球红细菌、地衣芽孢杆菌和植物乳杆菌的比例为4:1:1，或3:1:1，或2:1:1，或1:1:1，或1:2:2，或1:3:3，或1:4:4中任意一种。

3.一种如权利要求1-2任意一项所述的三联高效氨氮降解微生态制剂的制备方法，其特征在于：包括以下制备步骤：

步骤一：称取好氧曝气池淤泥样品1g，于100ml无菌PBS缓冲液中摇匀，90℃水浴10min，取0.1ml涂布于锰盐营养琼脂平板上，于28℃培养48h，取菌落大的细菌进行纯化再培养，芽孢染色和革兰氏染色后，、拮抗指示菌用营养肉汤培养18h后，取0.1ml涂布于营养肉汤琼脂平板，用内径为8mm的打孔器在平板打1孔，取0.1ml芽孢杆菌培养菌液注入孔内，28℃恒温箱内培养24h后，转移至地衣芽孢杆菌液体培养基；

步骤二：取河底污泥样品8g，加入100ml的灭菌海水，置于300ml的无菌三角瓶中，充分震荡15min，去除杂草、岩石等大颗粒物质，制备成样品悬浊液；

步骤三：取样品悬浊液5mL，加入含有50mL的无菌富集培养基的150ml三角瓶中，封口膜封口，28℃，2000lux光照培养15d，得到富集培养液；

步骤四：取2ml富集培养液，加入100ml的液体分离培养基，于28℃，2000lux光照，300rpm振荡培养3d，取100ul该培养液涂布在固体分离培养基上，28℃，2000lux光照，重复固体分离培养基上划线分离，直至得到菌落形态一致，将菌落转移至类球红细菌液体培养基；

步骤五：取河底污泥样品8g，进行10倍梯度法稀释，选取10^-3、10^-4、10^-5和10^-6 4个稀释度，向平板中加入0.1mL稀释液，再倾入冷却至50-60℃的含有2％碳酸钙的MRS琼脂培养基，混匀，37℃，培养36～48h后，挑取有较大溶钙圈的单菌落，进行10倍梯度稀释法纯化培养3～4次，挑选乳白色的单个菌落进行革兰氏染色镜检，选取实验结果为革兰氏阳性的菌株，转移至植物乳杆菌液体培养基；

步骤六：用接种环挑取类球红细菌和枯草芽孢杆菌菌株分别接种到类球红细菌液体培养基、地衣芽孢杆菌液体培养基和植物乳杆菌液体培养基中，于30℃、120rpm、摇床培养18-20h后，得到活化的类球红细菌、地衣芽孢杆菌和植物乳杆菌；

步骤七：将活化的类球红细菌、地衣芽孢杆菌、植物乳杆菌按不同的比例混合，制得三联高效氨氮降解微生态制剂。

4.如权利要求3所述的三联高效氨氮降解微生态制剂的制备方法，其特征在于：步骤一中，所述好氧曝气池淤泥样品取自南京市胜科水务有限公司好氧曝气池。

5.如权利要求3所述的三联高效氨氮降解微生态制剂的制备方法，其特征在于：步骤一中，所述地衣芽孢杆菌液体培养基的配方为氯化钠10g/l，蛋白胨10g/l，酵母提取物1g/l，纯化水1L。

6.如权利要求3所述的三联高效氨氮降解微生态制剂的制备方法，其特征在于：步骤二和五中，所述河底污泥样品取自南京市城市景观河河底淤泥。

7.如权利要求3所述的三联高效氨氮降解微生态制剂的制备方法，其特征在于：步骤三中，所述无菌富集培养基的配方为KH₂PO₄ 0.1g/L，酵母提取物1.5g/L，蛋白胨0.05g，CaCl₂0.05g，NaAc 1.0g/L，NH₄Cl 0.2g/L，MnSO₄ 0.05g，MgSO₄ 0.025g，FeSO₄ 0.002g，用蒸馏水定容至1000mL。