[发明专利]一种重组酯酶、基因、工程菌及拆分(R,S)-吲哚啉-2-甲酸乙酯的应用

权利要求书

1.一种立体选择性重组酯酶，其特征在于所述重组酯酶的氨基酸序列为SEQ ID No.1所示。

2.一种权利要求1所述立体选择性重组酯酶的编码基因，其特征在于所述编码基因的核苷酸序列为SEQ ID No.2所示。

3.一种权利要求2所述编码基因构建的重组载体。

4.一种权利要求3所述重组载体转化得到的重组基因工程菌。

5.一种权利要求2所述立体选择性重组酯酶编码基因在制备立体选择性重组酯酶中的应用。

6.一种权利要求1所述立体选择性重组酯酶在催化拆分(R,S)-吲哚啉-2-甲酸乙酯中的应用。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述应用以含立体选择性重组酯酶编码基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体、冻干菌体或湿菌体提取的纯酶为催化剂，以(R,S)-吲哚啉-2-甲酸乙酯为底物，以pH6.0、0.2M的磷酸盐缓冲液为反应介质构成反应体系，在25-40℃，150-200rpm条件下进行拆分反应，反应结束后，反应液分离纯化，得到(S)-吲哚啉-2-甲酸。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于所述催化剂质量用量以缓冲液体积计为0.01～20g/L，所述底物终浓度以缓冲液体积计为10～50g/L。

9.如权利要求7所述的应用，其特征在于所述湿菌体按如下方法制备：将含立体选择性重组酯酶编码基因的工程菌接种至含100μg/ml卡那霉素的LB液体培养基，在37℃下培养12-16h，获得种子液；再以体积浓度2％的接种量将种子液接种到新鲜的含100μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中，37℃下培养至菌体浓度OD₆₀₀为0.4-0.8，再加入终浓度为0.2mM的IPTG，28℃下诱导培养10-12h，然后在4℃下8000rpm离心10min，收集湿菌体。

10.如权利要求7所述的应用，其特征在于所述纯酶按如下方法制备：将含立体选择性重组酯酶编码基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体用50mM、pH 8.0的Tris-HCl缓冲液重悬，250W超声波破碎，超声2s，间隔6s，有效超声时间10min，在4℃下12000rpm离心15min，获得上清液；采用Ni-NTA金属螯合亲和层析，取上清液上样至预平衡Ni²⁺柱中，再依次用10mM咪唑水溶液、40mM咪唑水溶液、100mM咪唑水溶液、250mM咪唑水溶液洗脱，收集100mM咪唑水溶液的流出液，超滤膜脱盐浓缩，收集截留液，冻干，获得重组酯酶纯酶。