[发明专利]阿托帕沙溴酸作为新型JAK-STAT3信号通路抑制剂的用途和研究方法

说明书

阿托帕沙溴酸作为新型JAK‑STAT3信号通路抑制剂的用途，可用于抑制STAT3活性和STAT3下游基因表达来控制细胞增殖；对细胞因子诱导的STAT3活化和JAKs自磷酸化具有抑制作用；计算机分子模拟可结合于STAT3的SH2结构域，与JAK激酶JH1结构域有很高亲和力；可水平抑制肿瘤细胞生长。阿托帕沙溴酸作为新型JAK‑STAT3信号通路抑制剂的研究方法，包括如下步骤：细胞培养；蛋白提取；Western‑Blot；RNA提取；RT‑PCR及荧光定量PCR；荧光素酶活性分析；细胞活性分析；流式细胞术检测细胞周期；流式细胞术检测细胞凋亡；裸鼠移植瘤实验；计算机分子动力学模拟对接分析；数据计算及处理。本发明为进一步细胞周期检测和后续新型小分子药物研发奠定了基础。

技术领域

本发明属于医药应用领域，涉及阿托帕沙溴酸的医药新用途和研究方法，具体地说，是其作为JAK-STAT3信号通路抑制剂的用途和研究方法。

背景技术

JAK-STAT信号通路是细胞生长，激活，分化，凋亡及其功能过程中重要的细胞内信号转导通路。STAT3信号的异常激活可导致肿瘤发生，例如乳腺癌，肺癌。由于其在肿瘤形成中的重要功能，JAK(Janus激酶)和STAT(信号转导及转录激活因子)已成为药物设计的流行目标。尽管针对JAK和STAT的抑制剂已经FDA，EMA或临床试验批准，但也观察到某些缺陷，例如耐药性和副作用。此外，作为激酶抑制剂，这些药物可以与激酶的ATP袋结合，并且ATP袋是高度保守的，因此它可能导致脱靶和不可预测的毒性作用。因此，有必要开发新的JAK或STAT抑制剂。

阿托帕沙溴酸，Atopaxar Hydrobromide(AHB)，CAS号：474550-69-1，分子式C₂₉H₃₈N₃O₅F.HBr，分子量：608.54，又称为E5555 hydrobromide。E5555是一种可逆蛋白酶激活受体(Protease activated receptor，PAR)-1凝血酶受体拮抗剂，可以干扰血小板信号传导，目前尚无明确报道阿托帕沙溴酸的具体作用靶点。

发明内容

基于上述技术背景，本发明提供阿托帕沙溴酸作为新型JAK-STAT3信号通路抑制剂的用途和研究方法。

本发明主要目的是提供阿托帕沙溴酸作为新型JAK-STAT3信号通路抑制剂的用途。通过本研究所建立的基于STAT3信号通路萤火虫荧光素酶报告基因的抗肿瘤药物筛选平台，筛选发现了小分子化合物阿托帕沙溴酸，实验结果发现，其具有明显的STAT3抑制活性，高特异性、低细胞毒性，还抑制STAT3下游基因表达，包括socs3，细胞周期蛋白D1，c-Myc和Bcl-xL。此外，阿托帕沙溴酸经由JAKs-STATs信号通路来调节与细胞生长密切相关的一些下游基因的表达来控制细胞增殖。Western-Blot和MTT测定显示AHB可以剂量和时间依赖性方式抑制STAT3组成型活化的癌细胞活力，即DU145和A549，HepG2，Hela和MDA-MB-231。阿托帕沙溴酸也对细胞因子诱导的STAT3活化和JAKs自磷酸化具有抑制作用。分子模拟对接实验也在分子结构上直观的表明，阿托帕沙溴酸可结合于STAT3的SH2结构域并形成氢键，与JAK激酶JH1结构域具有很高的亲和力并形成氢键。暗示阿托帕沙溴酸是一种信号特异性抑制剂。详细调查表明，一些关键的STAT3下游基因参与细胞周期和细胞凋亡。荧光素酶活性和细胞毒性分析，阿托帕沙溴酸能够抑制荧光素酶活性，因荧光素酶的表达要依靠上游STAT3的转录活性，故荧光素酶活性可以正比显示STAT3的活性，而MTT细胞活性实验分析其具有较低的细胞毒性，因而说明阿托帕沙溴酸可直接作用于STAT3信号启动。