[发明专利]基于T5外切酶的双轮信号扩增目视检测层出镰刀菌的方法

说明书

本发明提供了一种基于T5外切酶的双轮信号扩增目视检测层出镰刀菌的方法，属于生物检测技术领域，所述方法包括：基因组DNA的提取、RPA反应、连接反应、外切反应、RCA反应及氧化还原反应。本发明基于T5外切酶和T4DNA连接酶建立了一种新的目视检测F.proliferatum的方法，通过将RPA产物一条链的两端连接成环从而将RPA和RCA偶联起来，目标序列经两轮扩增，检测限达到0.05pg，具有高灵敏度，本发明的方法具有无需标记，操作简单，不需要复杂的仪器，适用性高的优点。

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种基于T5外切酶的双轮信号扩增目视检测层出镰刀菌的方法。

背景技术

层出镰刀菌属于李瑟组镰刀菌，会导致茎和穗腐烂，造成农作物的减产和品质下降。在层出镰刀菌侵染过程中会产生真菌毒素，对人和牲畜的健康造成威胁。已建立基于PCR的层出镰刀菌检测用于保障作物品质产量和食品安全。然而，该方法需要PCR仪，操作熟练的技术人员，以及纯净的基因组作为模板，该检测方法的进行离不开实验室。因此，仍旧迫切需要建立简单灵敏的检测方法用于鉴定农作物及其加工产物中的层出镰刀菌存在。

由于生物传感器具有快速，高灵敏度和选择性，及低成本等优点，逐渐成为引人注目的技术，已经应用于多种生物组分的鉴定。在不同类型的生物传感器中，为了提高灵敏度，信号放大步骤是必须的。对于基因组DNA的检测，dsDNA通常是经过PCR或等温扩增如环介导的等温扩增(LAMP)或RPA获得。LAMP 需要四条或更多的引物，反应温度高于60℃，且获得的产物为大小不等的双链片段，它不能进行后续的克隆或测序，这些都限制了LAMP的应用。

滚环复制(RCA)是最常用的信号扩增方法之一，广泛应用于miRNA、单核苷酸突变、病原和癌细胞及其标志物检测等。然而，该扩增方法的缺点之一是当反应体系里有多于两个探针时会有高背景，这就降低了结果的可靠性。为了降低信噪比，许多RCA相关的策略中，无关DNA探针的3′-端被封闭。然而，封闭反应不是100％完全，未被封闭的DNA探针将会产生背景值。T5外切酶能够从5′→3′方向降解所有的单链或双链及带缺口的DNA。由于环状DNA不会被降解，而线状DNA能快速完全地降解为单核苷酸，该酶的这一特征可用来在 RCA相关的检测方法中降低背景值。

重组酶聚合酶扩增系统包括三种蛋白，分别是重组酶，单链结合蛋白以及聚合酶。重组酶与引物结合，扫描DNA模板。当发现同源序列时，引物和模板上的目标序列杂交，形成D环结构，单链结合蛋白结合其互补链。在聚合酶作用下，引物开始延伸。新生成的链成为新一轮扩增的模板。重组酶和单链结合蛋白的存在使RPA避开了PCR中的变性步骤。在RPA系统中仅需要两条引物，比 PCR引物略长。目前，使用Twist公司的试剂盒，用PCR引物通常也能进行有效扩增。该扩增一般在30分钟内完成，产物纯化后能够进行克隆和测序。与PCR 和LAMP对模板的高纯度要求相比，RPA系统能够用未纯化的模板进行有效扩增，这对于现场检测来说是一个优势。

G-四链体是一条富含G的DNA或RNA序列，由链内4条平行的或反平行的片段杂交构成，相邻4条链中各有3个相邻的鸟苷，通过氢键构成三个平行平面，G-四链体脱氧核酶具有类似过氧化氢酶活性。由于它简单、经济、易于改造和获得等优点，已经广泛应用到一系列无标记生物传感器中。为了提高灵敏度，该检测方法已经与一些信号放大步骤比如链置换扩增或滚环复制等偶联。以带有 G-quadruplex的反式互补序列的环为模板，RCA产生大分子量的带有 G-quadruplex的重复单位的单链DNA，多于8个G-quadruplex可构建为多重 G-quadruplex，它比单独8个G-四链体脱氧核酶具有更高的过氧化氢酶活性。

发明内容

针对以上检测方法中存在的技术问题，本发明提供一种没有背景值，灵敏度高、特异性强的基于T5外切酶的双轮信号扩增目视检测层出镰刀菌的方法。

本发明的技术方案为：一种基于T5外切酶的双轮信号扩增目视检测层出镰刀菌的方法，包括以下步骤：