[发明专利]检测鸡传染性支气管炎病毒的引物和探针组合以及试剂盒和检测方法

说明书

本发明涉及病毒检测技术领域，尤其涉及用于检测鸡传染性支气管炎病毒的引物和探针组合以及试剂盒和检测方法。含有鸡传染性支气管炎病毒RNA片段的待测物通过利用该引物即可在等温条件下、在很短时间内进行大量扩增，探针与扩增片段结合形成双标记物，可提高该检测方法的特异性，使对于鸡传染性支气管炎病毒的检测具有操作简便、检测成本低、特异性好、灵敏度高的优点。

技术领域

本发明涉及病毒检测技术领域，尤其涉及检测鸡传染性支气管炎病毒的引物和探针组合以及试剂盒和检测方法。

背景技术

鸡传染性支气管炎(Infectious Bronchitis，IB)是由鸡传染性支气管炎病毒(Infectious Bronchitis Virus，IBV)引起的一种急性和接触性呼吸疾病，传染性和致病性均很强。IBV是有囊膜、不分节段的单股正链RNA病毒，属于冠状病毒科γ冠状病毒属，其基因组不稳定，极容易发生点突变、缺失、插入等，导致基因变异株不断被分离。除此之外，IBV血清型众多，不同血清型、基因型间交叉保护很弱，使得免疫控制IB的效果一直不理想，发病率较高。肉鸡感染IBV后可导致生长缓慢以及饲料利用率下降，蛋鸡感染IBV后可导致产蛋量和蛋品质下降，均对养鸡产业有着极大的威胁与破坏性。

IB的临诊症状和病理变化与鸡新城疫、禽流感、鸡传染性喉气管炎相似，易发生误诊。目前对于IBV的检测方法主要有病毒分离鉴定、RT-PCR-琼脂糖凝胶电泳法、ELISA、环介导等温核酸扩增等方法，但上述方法往往需要昂贵的设备和专业的操作人员，检测成本高，操作条件苛刻，非常不便于基层兽医使用。

发明内容

针对现有IBV的检测方法检测成本高，操作条件苛刻的问题，本发明提供了用于检测传染性支气管炎病毒的引物和探针组合。

以及，本发明还提供了一种检测鸡传染性支气管炎病毒的试剂盒。

以及，本发明还提供了检测鸡传染性支气管炎病毒的方法。

为达到上述发明目的，本发明实施例采用了如下的技术方案：

用于检测传染性支气管炎病毒的引物和探针组合，所述引物的序列(如S EQ IDNO.1～2所示)为：

上游引物：5′-CGTCTTATAACTGGTAGATTGTCATCACTC-3′；

下游引物：5′-ATTACCACAAAAGGAGTACCTAGTAGACTG-3′；

所述探针的序列(如SEQ ID NO.3所示)为：5′-GTCACAACAGCGTGAGTTAGCCACGCAAAAG-THF-ATTAATGAGTGTGTTA-3′。

本组合中的引物为等温扩增引物，以IBV的S₂基因(GenBank：EF602461.1)序列为基础而设计得到，含有鸡传染性支气管炎病毒RNA片段的待测物利用上述引物可通过反转录重组酶介导等温核酸扩增技术(RT-RAA)在等温条件下进行大量扩增，不需对IBV模板反转录，在25min内即可完成目的基因片段的扩增。经凝胶电泳检测，所得的扩增产物条带单一、清晰，且大小符合目的片段，而不含鸡传染性支气管炎病毒RNA片段的待测物则不会产生扩增。经敏感性试验验证，利用该组合中的引物进行扩增后对IBV最低检测限为10²拷贝/μL，为普通PCR(10⁴拷贝/μL)灵敏度的100倍。

该探针基于上述下游引物而设计，探针上距离5′端31bp位置有一个碱基缺口，并以四氢呋喃(THF)残基修饰(SEQ ID NO.3中R即为THF)，当探针为单链时核酸内切酶不识别，只有当探针和上述引物扩增所得的扩增产物中的目的片段结合后核酸内切酶才开始工作，形成双标记的产物，从而可提高该检测方法的特异性，使其他病毒对检测结果无干扰。