[发明专利]一种可识别切割AGCT位点的耐高温限制性内切酶

说明书

本发明提供了一种可识别切割AGCT位点的耐高温限制性内切酶DFh2，该酶的氨基酸序列如SEQ NO：2所示，其编码基因序列如SEQ NO：1所示；DFh2酶可识别5’…AGCT…3’核酸片段中的AGCT回文结构区并在G和C之间进行切割形成平末端。酶DFh2具有良好的酶活，1.5μg限制酶DFh2在1×CutSmart Buffer缓冲体系和75℃或72℃温度下，在1h内可以将1nmol的含AGCT回文结构区的双链DNA片段在G和C之间完全酶切形成平末端。此外，限制酶DFh2具有良好的热稳定性，在95℃热育30min，酶活力仍保留90%以上；置于室温下30min，酶活力仍保留99%以上。本发明提供的特定全新II型限制酶DFh2，可以作为基因工程和基因检测的工具酶，并在低丰度特定基因片段的富集和检测中具有独特的应用。

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种可识别切割AGCT位点的耐高温限制性内切酶及其应用。

背景技术

限制性核酸内切酶是可以识别双链DNA上特定的核苷酸序列（通常为4到8个核苷酸），并对每条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键进行切割的一类酶，简称限制酶。按照亚基组成、酶切位置、识别位点和辅助因子等因素，可将限制酶分为I、Ⅱ和Ⅲ三种类型。Ⅱ型限制性内切酶（以下简称限制酶）是基因工程中重要的工具酶，其所识别的位置多为短的回文序列，所剪切的碱基序列通常即为所识别的序列。特定的II型限制酶在特定的识别序列切割DNA分子而不会在其它地方切割，精准的切割性能使其在基因重组、基因克隆、质粒构建、DNA片段分析和突变检测等方面应用广泛。目前发现和商品化的限制酶以常温酶为主，极少有耐高温的限制酶，然而耐热型酶由于稳定性良好，因此对于酶的分离纯化、运输存储和活性发挥均具有明显的优势，并且耐高温限制酶在特定领域中具有独特的应用，如在低丰度基因片段（微量等位基因片段和稀有基因突变片段等）的富集和检测中效果显著。

申请人取福建省境内普通农田中的牛粪秸秆类高温堆肥开展研究，在其微生态体系蛋白提取液中筛选耐高温即耐热限制酶。首先通过含4核苷酸回文结构区的DNA片段即酶切底物筛选体系获知了堆肥蛋白提取液中含有靶向AGCT位点的耐高温限制酶，接着利用转录组测序和目标基因捕获测序并结合生物信息分析，初步锁定了限制酶的候选编码基因，进行基因克隆和蛋白表达纯化并探究酶切特性，结果检测出了1种含有417个氨基酸的新型耐高温Ⅱ型限制酶DFh2，可以识别5’...AGCT...3’核酸片段的AGCT回文结构区并在G和C之间进行切割形成平末端，并且酶DFh2具有良好的酶活和耐高温性能。本发明提供的特定全新II型限制酶DFh2，可以作为基因工程和基因检测的工具酶，并在低丰度特定基因片段的富集和检测中具有独特的应用。

发明内容

本发明提供了新型的可识别5’...AGCT...3’核酸片段中的AGCT回文结构区并在G和C之间进行切割形成平末端的耐高温Ⅱ型限制性内切酶DFh2，并探究了其酶切特性和在特定基因突变检测中的应用。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案如下：

本发明的目的在于提供一种新型的耐高温Ⅱ型限制性内切酶DFh2，该酶的氨基酸序列如SEQ NO：2所示，其编码基因序列如SEQ NO：1所示；DFh2酶可识别5’...AGCT...3’核酸片段中的AGCT回文结构区并在G和C之间进行切割形成平末端。

酶DFh2具有良好的酶活，1.5μg限制酶DFh2在1×CutSmart Buffer缓冲体系和75℃或72℃温度下，在1h内可以将1nmol的含AGCT回文结构区的双链DNA片段（5’-FAM-F15-AGCT-R15-TAMRA-3’）在G和C之间完全酶切形成平末端。此外，限制酶DFh2具有良好的热稳定性，在95℃热育30min，酶活力仍保留90%以上；置于室温下30min，酶活力仍保留99%以上。

附图说明

图1是5’-FAM-F15-NNNN-R15-TAMRA-3’即含有4核苷酸回文结构区的DNA片段体系的结构示意图，未免大量重复图中含义详见文中表述。