[发明专利]一种高热稳定性尿酸酶及其应用

说明书

本发明提供了一种高热稳定性尿酸酶及其应用。具体地，本发明提供了一种突变的尿酸氧化酶，其在第12位赖氨酸(K)、第286位谷氨酸(E)、第296位丝氨酸(S)、第302位半胱氨酸(C)、第244位赖氨酸(K)、和/或第246位丝氨酸(S)引入突变以形成二硫键。本发明的突变的尿酸氧化酶的酶活性不受影响，热稳定性显著提高，并且能够抵抗蛋白酶K的降解，为获得更稳定的痛风治疗药物提供了重要的药物前体。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体地涉及一种基于蛋白质晶体结构设计的高热稳定性尿酸酶及其应用。

背景技术

高尿酸血症和痛风是常见的代谢疾病，我国痛风的整体患病率在1％-5％左右，国内痛风患者人数至少1700万人，高尿酸血症整体患病率为13.2-21％。随着人们饮食结构的改变，更多地摄入高蛋白高嘌呤类化合物的食物，高尿酸血症和痛风的发病率越来越高，严重危害人民身心健康，人们对治疗高尿酸血症和痛风新药的需求日益剧增。痛风是由于体内嘌呤代谢紊乱，尿酸含量过高引起的。正常情况下，体内需要被代谢的嘌呤都会在转化为黄嘌呤或者次黄嘌呤后，在黄嘌呤氧化酶作用下生成尿酸。人体内缺乏继续分解尿酸的能力，一般会通过肾脏排泄尿酸。在嘌呤摄入过多或肾脏功能受损的情况下，体内的尿酸累积会导致高尿酸血症。过多的尿酸会在体内形成针状晶体，被免疫系统识别，释放白细胞介素-1和其它细胞因子，起始免疫反应，促发急性痛风。

痛风的主要治疗方式是通过药物降低血液中的尿酸浓度。一般推荐将血尿酸浓度控制在6mg/dL以下，该浓度被称为血液尿酸(serum uric acid，SUA)的亚饱和浓度。血液中的尿酸浓度长期维持在亚饱和浓度以下可以减少体内的尿酸结晶，甚至使痛风石缩小。常规的治疗药物包括秋水仙碱、非甾体类抗炎药、促肾上腺皮质激素，以及黄嘌呤氧化酶抑制剂和利尿剂的联合使用。但部分患者由于对药物不耐受或因为药物禁忌症不适用，无法通过上述药物降低体内的血尿酸浓度。

尿酸氧化酶(EC 1.7.3.3)是一种由四个单体组成的四聚体酶，每个单体可以结合一个尿酸分子。人和猿类在进化过程中发生了突变，编码尿酸氧化酶的基因不再起作用。在除了人和猿类以外的哺乳动物中，尿酸会在尿酸氧化酶的作用下，被继续分解生成水溶性更好的尿囊素，并可继续被分解排泄。Pegloticase是一种聚乙二醇修饰的尿酸酶，于2010年在美国批准上市，可替代传统口服药物，以静脉注射的方式治疗痛风。给药后，血尿酸盐浓度可降至尿酸在血液中的溶解度(6.8mg/dL)以下，有利于尿酸盐结晶溶解，临床上可改善痛风的症状。但这种药物最大的副作用在于注射过程中的过敏反应。Rasburicase(SR29142)是一种在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中表达的尿酸酶。Rasburicase可在用常规办法无法治疗的严重痛风病人中取得明显疗效，缩小痛风石，提高病人手指的灵活度。但是该类蛋白药物在注射过程的过敏反应仍是其应用上的最大挑战。

与小分子化学药物相比，蛋白酶类药物在制备、包装、运送和临床使用上都更需要保证稳定性。稳定的蛋白酶类药物可以增加体内药物的有效浓度，使药物发挥最大的效能，并在一定程度上降低免疫原性，减少免疫反应的发生。

传统提高蛋白质热稳定性的方法不考虑蛋白质结构与功能之间的关系，构建突变文库，筛选热稳定性较好的突变体，费时费力。于是，人们通过同源比对、蛋白质表面电荷优化、二硫键设计、脯氨酸效应设计、基因蛋白质解折叠设计、温度因子设计等多种方法，希望推进理性设计提高蛋白质热稳定性。