[发明专利]一种B型猪肠道病毒及其应用

权利要求书

1.一种B型猪肠道病毒，其特征在于，所述B型猪肠道病毒（Porcine enterovirus B，PEV-B），保藏号为：CGMCC No.10405，保藏日期为2015年3月2日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮政编码：100101，命名为B型猪肠道病毒Ch-SDbz-W2Y。

2.根据权利要求1所述的一种B型猪肠道病毒在制备卵黄抗体中的应用。

3.根据权利要求2所述的一种B型猪肠道病毒在制备卵黄抗体中的应用，其特征在于，所述卵黄抗体是以B型猪肠道病毒为免疫原获得卵黄抗体。

4.根据权利要求3所述的一种B型猪肠道病毒卵黄抗体的制备方法，其特征在于，包括：

1）B型猪肠道病毒免疫原的制备；

2）卵黄抗体的制备。

5.根据权利要求4所述的一种B型猪肠道病毒卵黄抗体的制备方法，其特征在于，其步骤为：

1）B型猪肠道病毒免疫原的制备；

①采集腹泻猪病料，利用Vero细胞对腹泻猪病料中含有的病毒进行初步分离，然后将初步分离的病毒通过PCR检测方法进行病毒的再次分离，最后提取病毒RNA，进行全基因组的克隆、鉴定、测序，得到B型猪肠道病毒；

②B型猪肠道病毒免疫原制备

A、根据转瓶生产工艺，按体积分数比，在1份细胞培养液中加入1份Vero细胞，进行增殖，当细胞培养液中Vero细胞浓度增至5×10⁶个/mL时，按细胞培养液总体积百分比，再接入1%的病毒滴度为10^7.5TCID50/0.1mL的B型猪肠道病毒，待细胞培养液中80%以上的Vero细胞出现细胞病变时收获病毒液，得到猪肠道病毒抗原；

B、按重量份数计，取96份抗原、4份吐温80，混合均匀，制得乳化水相，备用；

C、按重量份数计，取94份白油、1.5份硬脂酸铝，边搅拌白油边加入硬脂酸铝，搅拌至溶剂透明，然后加入6份司本80，混合均匀、121℃，灭菌20分钟，制得油相，备用；

D、按乳化水相：油相的比列为1:1.5，在匀质机内加入油相，调节转速至3000r/min，搅拌5分钟，加入乳化水相，调节转速至10000r/min，乳化6分钟，得到B型猪肠道病毒免疫原；

2）卵黄抗体的制备

①免疫接种

选取禽白血病、禽网状内皮组织增殖病均为阴性的高峰期产蛋蛋鸡；

取B型猪肠道病毒免疫原对高峰期产蛋蛋鸡进行基础免疫接种；在基础免疫接种后的14日进行一次加强免疫接种；在一次加强免疫接种后的14日进行二次加强免疫接种；

②卵黄抗体提取

A、取二次加强免疫接种后14日的高峰期产蛋蛋鸡所产高免鸡蛋，测定高免鸡蛋蛋黄中的B型猪肠道病毒抗体效价，当抗体效价≥1:32时收集高免鸡蛋，2~8℃贮存；

B、无菌条件下收集卵黄液，按体积份数计，在1份卵黄液加入6份浓度为0.15mol/L的醋酸盐缓冲液，混合均匀，调节pH值为5.2，2~8℃保存过夜，离心，制得上清液Ⅰ；

C、在上清液Ⅰ中加入辛酸至终浓度为2%，混合均匀，2~8℃存储过夜，离心，得到上清液Ⅱ，将上清液Ⅱ通过孔径为0.45μm的滤膜进行过滤，调节pH值为7.4，再通过截留分子量为50kDa的超滤膜进行浓缩过滤，制得上清液Ⅲ；

D、在上清液Ⅲ中加入浓度为0.08%的甲醛溶液，20~25℃条件下灭活24小时，过滤，制得卵黄抗体。

6.根据权利要求5所述的一种B型猪肠道病毒卵黄抗体的制备方法，其特征在于，所述基础免疫接种中B型猪肠道病毒免疫原的接种量为2.0mL/只；

一次加强免疫接种中B型猪肠道病毒免疫原的接种量为2.0mL/只；

二次加强免疫接种中B型猪肠道病毒免疫原的接种量为2.0mL/只。

7.根据权利要求5所述的一种B型猪肠道病毒的卵黄抗体，所述的卵黄抗体的效价﹥1:16。