[发明专利]一种谷氨酸棒杆菌同时基因敲除及基因表达抑制的双功能系统及应用

说明书

本发明公开了一种谷氨酸棒杆菌同时基因敲除及基因表达抑制的双功能系统及应用。本发明构建的CRISPR/Cas12a系统的载体，包括Cas12a蛋白基因和crRNA的编码DNA。本发明构建的CRISPR/Cas12a基因载体能够对谷氨酸棒杆菌基因组同时进行基因敲除和基因表达抑制，具有实验周期短、节省时间和效率高等优点。

技术领域

本发明涉及基因编辑领域，具体涉及一种谷氨酸棒杆菌同时基因敲除与基因表达抑制的CRISPR/Cas12a系统及其应用。

背景技术

CRISPR/Cas(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)系统作为细菌和古细菌的获得性免疫系统，通过RNA介导，特异性的切割外源遗传物质，用以对抗入侵的病毒。近年来，该系统被成功的应用到大肠杆菌、拟南芥、酿酒酵母以及小鼠等物种中，实现快速高效的基因敲除、基因插入和基因沉默。

CRISPR/Cas12a属于V-A型CRISPR系统。该系统发挥基因编辑的作用建立在CRISPRRNA(crRNA)与Cas12a蛋白形成的蛋白核酸复合体，在crRNA 的引导下，识别富含T的PAM位点(TTTN)的3’端下游序列；而对目的片段的切割是由crRNA上长度为20bp的向导序列与目的基因上的特定序列互补，招募Cas12a蛋白对目的基因进行切割。而当crRNA的长度小于17bp时，Cas12a 蛋白仍然能够结合到DNA上，但缺失了DNA切割的能力。

谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)是革兰氏阳性菌，普遍认为其安全，无致病性，被广泛的用于工业生产谷氨酸，赖氨酸等氨基酸，以及其他应用于食品、饲料及医药的化学品。

早前，谷氨酸棒杆菌的菌株主要通过诱变育种的方法获得高产工业菌。随着全基因组测序的发展，利用基因工程的方法定向改造谷氨酸棒杆菌基因组越来越受到重视。目前，除了pK18mobsacB/pK19mobsacB介导的同源重组法外， CRISPR/Cas的方法也被用于谷氨酸棒杆菌。由于谷氨酸棒杆菌对外源DNA的排斥和消化能力较强，且同源重组酶活力低下，从而导致谷氨酸棒杆菌转化效率与同源重组修复效率低下。虽然单一功能的CRISPR系统(如基因敲除和基因抑制)已经实现，但基因组上多位点同时操作却难以成功。

发明内容

针对上述问题，本发明提供了一种谷氨酸棒杆菌同时基因敲除及基因表达抑制的双功能系统，其具有较高的基因敲除与基因抑制效率。为此，本发明采用以下技术方案：

一种谷氨酸棒杆菌同时基因敲除及基因表达抑制的双功能系统，其特征在于：

所述的双功能系统包含cas12a表达载体和crRNA表达载体；

所述cas12a表达载体包括cas12a序列和启动子序列，所述cas12a序列如SEQ IDNo.1所示，所述启动子序列如SEQ ID No.2所示，并连接在cas12a序列的起始密码子ATG前；

所述的crRNA表达载体包含同源修复序列，crRNA1和crRNA2序列，所述 crRNA1序列如SEQ ID No.3所示，crRNA2序列如SEQ ID No.4所述，所述 crRNA1序列为18～24bp的引导序列、与目的基因的N18～N24序列相同，所述 crRNA2序列为13～16bp的引导序列，与目的基因的N13～N16序列相同。

进一步的，所述cas12a表达载体的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。