[发明专利]巴氏杜氏藻甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子及其应用

说明书

本发明公开一种巴氏杜氏藻甘油醛‑3‑磷酸脱氢酶启动子及其应用，涉及分子克隆领域。本发明采用了来自特氏杜氏藻的同属的巴氏杜氏藻的Gapdh启动子来驱动RNA干扰片段，使得该片段能够在特氏杜氏藻细胞中稳定高效的表达。该载体中采用了博来霉素抗性进行筛选，使得我们能够筛选到单克隆突变株。相对荧光定量PCR结果：可以看出RNA干扰后的特氏杜氏藻株系中，特氏杜氏藻甜菜碱合成基因胆碱脱氢酶DtCHDH的表达量显著下调。因此，本发明使用了新的启动子以及验证了启动子的高效表达，并首次在特氏杜氏藻中实现对特氏杜氏藻甜菜碱合成基因胆碱脱氢酶DtCHDH的干扰。

技术领域

本发明涉及分子克隆领域，涉及一种巴氏杜氏藻甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子(DbGapdh promoter)及其应用，特别涉及藻类干扰载体的构建克隆系统，具体涉及一种杜氏藻属结构基因(如甜菜碱合成相关基因)的RNA干扰载体的构建及其应用。

背景技术

RNA干扰(RNA interference，RNAi)是指一种生物体内由双链RNA诱发的基因沉默现象。当细胞中导入与内源性mRNA同源的双链RNA时，该mRNA发生降解而导致基因表达沉默。RNAi最早是在研究线虫中被发现的，随后陆续发现于真菌、拟南芥、果蝇、锥虫、水螅、涡虫及斑马鱼等多种真核生物中，并逐渐证实植物中的转录后基因沉默、共抑制介导的病毒抗性等现象均属于RNAi在不同物种的表现形式。甜菜碱是公认的在细胞中起着无毒渗透保护作用的细胞相溶性物质，广泛存在于植物、动物、细菌等多种生物体中。植物中甜菜碱因其结构不同，其生物合成途径和催化合成所需要的酶也各不相同。

建立稳定高效的盐藻生物反应器至关重要的一步是寻找合适的内源性启动子驱动表达外源基因。甘油醛-3-磷酸脱氢酶(缩写为Gapdh)催化糖酵解的第六步。Gapdh基因的表达是由高活性的启动子调控的，Gapdh基因的5'端调控序列已作为一个较优启动子元件广泛用于真菌，植物和细菌中启动外源基因的高效表达。Gapdh基因还涉及几种非代谢过程，包括转录激活，细胞凋亡的启动等。

发明内容

为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种巴氏杜氏藻甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子。

本发明的另一目的在于提供上述巴氏杜氏藻甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子的应用。

本发明的另一目的在于提供一种杜氏藻属结构基因的RNA干扰载体。

本发明的另一目的在于提供上述杜氏藻属结构基因的RNA干扰载体的应用。

本发明为了在特氏杜氏藻特定基因表达下调，验证基因功能，本发明构建了一种在特氏杜氏藻中进行RNA干扰的载体。该让该载体在特氏杜氏藻细胞内稳定表达，并实现了对特氏杜氏藻甜菜碱合成基因胆碱脱氢酶DtCHDH的干扰。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

本发明提供一种巴氏杜氏藻甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子，是从巴氏杜氏藻的基因组中获得的，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明还提供一种巴氏杜氏藻甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子在杜氏藻属中启动结构基因中的应用。

优选的，所述的杜氏藻属包括特氏杜氏藻、巴氏杜氏藻、杜氏盐藻等；

优选的，所述的结构基因为甜菜碱合成基因胆碱脱氢酶CHDH。

本发明还提供一种杜氏藻属结构基因的RNA干扰载体，是通过酶切连接和同源重组的办法构建得到，以pCR2.1为骨架载体，将Dbzdspro启动子序列、ble-EGFP序列以及Dblycbter终止子序列按转录方向依次连接在一起；接着再将上述所述的巴氏杜氏藻甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子(Dbgapdhpro启动子)、结构基因正向片段、pdk和cat内含子、结构基因反向片段以及Dbpsyter终止子按转录方向依次连接在一起，得到杜氏藻属结构基因的RNA干扰载体。