[发明专利]灰树花麦角硫因基因Gfegt1和Gfegt2在合成麦角硫因中的应用

说明书

本发明公开一种灰树花麦角硫因基因Gfegt1和Gfegt2在合成麦角硫因中的应用，属于生物合成生物学领域。本发明利用同源比对的方法找出灰树花中可能的麦角硫因合成酶基因Gfegt1、Gfegt2，并利用提取灰树花RNA后反转录成cDNA进行克隆获取。本发明构建利用酵母启动子启动Gfegt1、Gfegt2两个基因表达的载体并转化至酿酒酵母EC1118中，随后通过添加底物让酿酒酵母吸收，在体内反应催化合成麦角硫因，进行提取后通过高效液相色谱(HPLC)检测麦角硫因产物的生成，实现了体内生物合成麦角硫因。本发明为麦角硫因的生产提供一条全新的生物合成途径。

技术领域

本发明属于生物合成生物学领域，特别涉及一种灰树花麦角硫因基因Gfegt1和Gfegt2在合成麦角硫因中的应用。

背景技术

麦角硫因(Ergothioneine，简称EGT)是一种抗氧化物质，在细菌和真菌起着维持氧化还原稳态，信号传导，细胞代谢等重要作用。Tanret(1909)首次在麦角菌(Clavicepspurpurea)发现该物质，并为其命名。麦角硫因是组氨酸三甲基甜菜碱的衍生物，在咪唑环上第二个C原子连接着一个巯基，以硫酮的形式存在，其标准还原电势会比以硫醇形式存在的标准还原电势低，因此麦角硫因会比其他硫醇类化合物(如谷胱甘肽)更稳定(Cheah etal.,2012)。

麦角硫因具有在体外和少数体内具有多种抗氧化和保护细胞的功能，包括自由基的清除、抗辐射、抗炎症、修复神经元损伤等(Cheah et al.,2012)，但不能在动物体内合成，只能从细菌或真菌中获取。麦角硫因存在于结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)，耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)，蓝细菌(Certaincyanobacteria)，甲基杆菌属(Methylobacterium)以及大部分的非酵母真菌，包括粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)等丝状真菌(Cumming et al.,2018)。其中，大部分食用菌中含有丰富的麦角硫因，其中美味牛肝菌(Boletus edulis)含量较高，每克干重中有7.27mg麦角硫因(Kalaras et al.,2017)。

由细菌中五个合成酶基因形成的一个基因簇egtABCDE和真菌中两个合成酶基因Egt1、2组成了两个不同的合成途径。细菌合成途径中，egtA催化谷氨酸和半胱氨酸生成γ-半胱酰胺-谷氨酸；egtD催化组氨酸甲基化形成组氨酸甜菜碱；egtB在氧气和亚铁离子的协助下，将γ-半胱酰胺-谷氨酸的硫原子与组氨酸甜菜碱咪唑环上的碳原子结合形成一个含有亚砜结构的化合物；egtC催化组氨酸甜菜碱半胱氨酸亚砜上的谷氨酸裂解；egtE则催化CS键的裂解，最终形成麦角硫因。真菌合成途径中，egt1催化甲基化组氨酸，与半胱氨酸形成CS键，形成组氨酸甜菜碱半胱氨酸亚砜；egt2使前提物的CS键裂解，形成麦角硫因。由此可见，由于只需两个酶参与合成反应，因此真菌的生物合成途径远远简洁于细菌的合成途径，对麦角硫因的生产及应用研究提供更多的便利。

目前，已有报导通过构建含egtABCDE的大肠杆菌(Escherichia coli)工程菌株以大量发酵麦角硫因，产量达到24mg每升发酵液(Osawa et al.,2018)。然而关于真菌类的egt1、2的研究都是以蛋白结构研究为主(Hu et al.,2014,Irani et al.,2018)，而且只是以粗糙脉孢菌为研究基础，目前还没有更多以发酵为主的应用和以食用菌为基础的相关研究。而林俊芳(2018)对金针菇中麦角硫因三个基因进行克隆并验证其活性。因此针对食用菌中egt1、2目的基因的进行研究应用是具有良好前景的。

发明内容

为了克服现有技术中麦角硫因的生物合成途径的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种灰树花麦角硫因基因Gfegt1和Gfegt2在合成麦角硫因中的应用。本发明只需两个基因即可进行麦角硫因的从头合成。

本发明的另一目的在于提供灰树花麦角硫因基因Gfegt1、Gfegt2。