[发明专利]含一种绝缘子的慢病毒稳定表达载体及其构建方法

说明书

本发明涉及含一种绝缘子的慢病毒稳定表达载体及其构建方法，属于生物医学工程技术领域。其将绝缘子IS22·3整合入慢病毒载体，慢病毒载体上包括慢病毒载体启动子；所述IS22·3的序列如SEQ ID No.1所示。本发明成功开发了含有一种染色质隔离子(IS22·3)的新型慢病毒载体，与传统的慢病毒载体相比其表现出稳定和有效的表达功能。这种慢病毒载体有望成为基因治疗和细胞转染研究的新选择。

技术领域

本发明涉及含一种绝缘子的慢病毒稳定表达载体及其构建方法，属于生物医学工程技术领域。

背景技术

慢病毒载体(Lentiviral vector，LV)属于逆转录病毒载体，由于其可有效转染分裂细胞和非分裂细胞，并将外源基因整合进入基因组DNA，从而稳定表达目的基因。是哺乳动物细胞中基因转移的有效载体，广泛应用于基础实验研究和基因治疗。

然而，慢病毒载体在外源性基因长期稳定表达和多基因转染方面也有其局限性。通常病毒载体转入的基因在一段时间后失去表达，即外源基因沉默。一般认为慢病毒载体转入基因沉默的机理有三种：通过病毒长末端重复序列(Long terminal repeat，LTR)远端的细胞基因组的内在反式作用因子、内部启动子内的CpG位点的甲基化、染色质凝聚使启动子失活，进而使转入基因沉默。而且上述及其他种种原因，使得外源性基因表达在不同类细胞，甚至在同类细胞不同个体表现出表达的巨大差异性。这些均严重影响实验研究和基因治疗。

目前商业性慢病毒载体已发展至第三代(如Life Technologies公司的产品)，在一、二代试验性慢病毒载体的基础上推出了商用性的第三代产品，但均着重于安全性的改良。针对内部启动子内的CpG位点的甲基化，研究者曾采用MSCV、EF1启动子，近期SFFV启动子多用于干细胞转染，但在表达效率和稳定性方面仍有不足。

Francisco Martin等利用绝缘子(IS2)构建了慢病毒蛋白稳定表达载体(1)，本发明在上述研究基础上成功构建了含IS2的慢病毒稳定RNA干扰(RNAi)载体(2)。

发明内容

本发明的目的是克服上述不足之处，提供含一种绝缘子的慢病毒稳定表达载体及其构建方法，将一种具有绝缘子特征，即CTCF(CCCTC binding factor)结合域序列，与启动子组合形成慢病毒的构件，从而克服基因沉默及外源基因表达的不稳定性。

本发明的技术方案，含一种绝缘子的慢病毒稳定表达载体，将绝缘子IS22·3整合入慢病毒载体，慢病毒载体上包括慢病毒载体启动子；所述IS22·3的序列如SEQ ID No.1所示。

真核生物基因组DNA内也存在固有的特殊序列参与表达调控，如绝缘子，防止前面提到的调控元件干扰和染色质凝聚，维持基因表达的基本稳定性。

本发明中采用的绝缘子(Insulator)DNA序列(IS22·3)位于人22号染色体，该序列位于具有螺旋结构域蛋白质基因(ZDHHC8)和网状内皮素-4受体(Endothelin 4receptor)基因之间(3)。ZDHHC8上游调节区中具有与CTCF结合的DNA序列，可以阻断增强子的作用。

本发明模拟基因组结构，将该序列作为载体启动子的调控元件整合到慢病毒载体，具体结构如图1所示。如图1所示，构建以U6为代表的RNA聚合酶Ⅲ启动子和以SFFV为代表的RNA聚合酶Ⅱ启动子以及上述二类的融合启动子CMV/H1驱动的稳定表达载体。

图1含绝缘子(IS22·3)的慢病毒载体，A为RNA聚合酶Ⅲ启动子U6；B为RNA聚合酶Ⅱ和Ⅲ启动子的融合体，CMV为来自于RNA聚合酶Ⅱ启动子CMV的增强子序列，H1为人RNA聚合酶Ⅲ启动子；C为RNA聚合酶Ⅱ启动子SFFV的绝缘子，MSC为多克隆位点。

本载体构建以Invitrogen公司出品的慢病毒载体(pLenti6V5-GW-LaZ)为骨架，尚整合以下元件：