[发明专利]一种中药材半夏及其易混品的鉴别方法

说明书

本发明涉及一种中药材半夏及其易混品的鉴别方法，该方法包括如下步骤：1)提取待鉴定样品的DNA；2)第一次PCR扩增：以步骤1)提取的DNA为模板，使用ITS 4/5通用引物对进行PCR扩增；3)第二次PCR扩增：以对步骤2)的PCR产物为模版，以多重位点特异性PCR引物对分别进行PCR扩增；4)对步骤3)的PCR扩增产物进行电泳，检测出620bp条带的待测样品鉴定为半夏，检测出346bp条带的待测样品鉴定为虎掌，检测出167bp条带的待测样品鉴定为鞭檐犁头尖，而其他易混品无上述扩增条带。

技术领域：

本发明涉及中药材鉴别领域，具体涉及一种中药材半夏及其易混品的鉴别方法。

背景技术：

半夏Pinellia ternate为天南星科植物的块茎，具有燥湿化痰、降逆止呕和消痞散结的功效，善治脏腑之湿痰，止呕之要药。半夏是一味常用的大宗药材，不仅临床配方使用，也是多种中成药的原料药，使用量大；而野生半夏因大量釆挖、环境遭到破坏，资源逐渐减少；同时栽培半夏因种植过程规范化、标准化不够，产量不断减少，不能满足药材市场需求，且价格高。因此半夏市场上存在多种同科或同属的易混品，这对种植栽培、用药安全等方面造成严重问题，常见的易混品有天南星科半夏属虎掌Pinelliapedatisecta、天南星科犁头尖属鞭檐犁头尖Typhoniumflagelliforme(亦称为水半夏)等。

半夏及其易混品在外观形态上十分相似，且具有类似的化学成分，因此利用性状鉴别、理化鉴别等方法难以区分开。建立一种用于快速、准确鉴别半夏及其易混品的方法，对于保障半夏种茎的种植栽培、半夏饮片的用药安全有重要意义。设计半夏的特异性引物，并用于鉴别半夏，以区分其易混品，具有节省时间、降低成本和提高效率的优点。

多重PCR(multiplexPCR)是在普通PCR的基础上于一个PCR反应体系中加入多对特异性引物，针对多个DNA模板或同一模板的不同区域扩增多个目的片段的PCR技术。多重PCR可以同时扩增多个目的基因，满足同时分析不同DNA序列的需要，它具有节省时间、降低成本、提高效率等优点。多重PCR己被成功应用到了生物学的多个方面，以及基因缺失、突变和多态性分析等。

由于多重PCR要求在同一反应体系中进行多个位点的特异性扩增，因而技术难度增大，一个理想的多重PCR反应体系，并非单一PCR的简单混合，需要针对目标产物，进行全面分析、建立适宜的反应体系和条件。多重PCR的目标是多个目的片段的扩增，因此目的片段的选择是核心。目的片段必须具有高度特异性，才能保证基因检测的准确性，避免目的片段间的竞争性扩增，实现高灵敏的扩增反应。此外，各个目的片段之间需具有明显的长度差异以利于鉴别。不同引物对之间互补的碱基不能太多，否则引物之间相互缠绕，严重影响反应结果。综合各个解链温度Tm，在Tm值允许范围内，选择较高的复性温度以减少引物和模板间的非特异性结合，确保PCR反应的特异性。

多重PCR与常规PCR相比，有几个明显的优势：①多重PCR可同时扩增不同的基因组，因此可快速筛选同一基因组的不同区域或者不同物种的基因组，前者可用于检测结果确认，后者可用于复方中的不同组分检测；②选其中一个引物对作为阳性对照，可避免样本由于PCR抑制物质存在所导致的假阴性结果；③多重PCR所需试剂及样品量较少，因而节省大量人力、物力。

多重PCR成功的关键是引物特异性好，使单一PCR就能得到很好的效果，没有非特异性条带出现。

唐晓晶的《DNA分子标记在中药材鉴定中的应用研究》公开了半夏及其混淆品位点特异性PCR方法鉴别，利用GenBank中天南星科不同属药材之间的ITS基因序列，通过比对寻找种间SNP的分布情况，并利用位点特异性PCR方法进行SNP的检测。通过对大量不同产地半夏的检测，表明根据半夏ITS序列设计的引物PtITSF和PtITSR能成功对所有半夏样品进行扩增，得到395bp的条带，而对虎掌和水半夏等混淆品不扩增，没有条带，从而达到准确鉴别半夏的目的，保证了临床用药的安全。但该方法并不是多重位点特异性的PCR方法，因此仅仅能够将半夏与其他混伪品区分开来，但并不能判断其他混伪品是什么产品，因此具有局限性。