[发明专利]一种兽用狂犬病灭活疫苗的制备方法及该疫苗包含的稳定剂

说明书

本发明提供一种兽用狂犬病灭活疫苗的制备方法及该疫苗包含的稳定剂，制备方法中病毒浓缩流程为：(1)病毒上清液经以0.8～1L/min流速持续透过300KD膜包，体积浓缩至原体积的1/50～1/40得粗浓缩液；(2)向粗浓缩液中加入10～15倍体积的PBS溶液，在浓缩压力为0.5～1.0bar，流速为1.8～2L/min的条件下透过300KD膜包，体积浓缩至透过前的1/4～2/5时调整流速为0.8～1L/min，持续浓缩至所述粗浓缩液原体积。本发明通过优化病毒浓缩流程，针对不同抗原浓度采用不同的膜透过流速，在浓缩过程即可去除30～50％杂蛋白，同时毒价维持在90％以上，制成的疫苗更加稳定、高效。

技术领域

本发明涉及生物制品领域，尤其涉及一种兽用狂犬病灭活疫苗的制备方法及该疫苗包含的稳定剂。

背景技术

狂犬病(Rabies)是由弹状病毒科、狂犬病病毒属的狂犬病病毒(Rabiesvirus)感染引起的一种人兽共患传染病，又称恐水病、疯狗病等，是一种侵害中枢神经系统的急性病毒性传染病，所有温血动物包括人类，都可被感染，该病主要是通过动物唾液中携带的狂犬病病毒液侵入体内而受到感染，犬是我国狂犬病毒最主要的贮藏宿主和传播媒介。狂犬病的潜伏期一般是半个月到三个月，多数集中在30～90天，狂犬病一旦发病，其发展速度很快，多数在3～5天，很少有超过10天的，病死率为100％。狂犬病在世界各个地方均有流行。针对狂犬病，由于目前尚无特效治疗药物，疫苗免疫接种可以有效控制和预防狂犬病的发生，现在用于预防动物狂犬病的疫苗有弱毒苗和灭活苗，狂犬病弱毒活疫苗，制备简单，但毒力存在反强的可能，安全性低，故而现在普遍使用灭活苗。近年来，狂犬疫苗的制备技术已经逐渐提高，但是仍然不能避免狂犬病的发生，因此必须提高技术，加快狂犬病疫苗质量提升的步伐。

狂犬疫苗的安全性和有效性主要受病毒滴度、抗原纯度、灭活工艺及佐剂等因素影响，常规工艺生产的狂犬病毒灭活疫苗在临床应用中有一定的副反应，主要与病毒抗原中所含的抗原外成分有关，包括：病毒培养用动物细胞的残留蛋白质和DNA、血清、细胞碎片、灭活剂等。这些外源成分不仅会引起免疫动物的副反应，而且会大大降低疫苗的效力。现在狂犬病灭活疫苗的生产方法中，主要是转瓶培养，转瓶培养的缺点是生产效率低，批间差异大，后期通过沉降的方式去除细胞大分子，抗原纯度无法提高，杂蛋白含量增加，导致疫苗产品免疫原性弱并存在安全隐患。通过电镜检测对比纯悬浮和转瓶培养病毒粒子的完整性，发现悬浮培养获得的病毒粒子形态清晰，膜结构完整。

狂犬病灭活疫苗生产中，通常需要添加低浓度的人血清白蛋白提高疫苗的保存期，增加了动物源性外源物质的污染，是临床上该疫苗发生副反应的主要原因之一。常规疫苗添加蛋白保护剂延长疫苗稳定性，由于配方复杂增加了动物体的代谢负担，同时增加了成本。为了后期疫苗品质的提升和临床使用的安全性，急需要改进现有生产工艺。

发明内容

本发明提供一种兽用狂犬病灭活疫苗的制备方法及该疫苗包含的稳定剂，通过优化生产过程中的浓缩、纯化操作，并采用特定的稳定剂克服现有技术狂犬病疫苗抗原纯度较低，稳定性和质量难以兼顾的缺陷。

第一方面，本发明提供一种兽用狂犬病灭活疫苗的制备方法，包括病毒浓缩流程，具体操作为：

(1)使病毒上清液经以0.8～1L/min流速持续透过300KD膜包，至所述病毒上清液体积浓缩至原体积的1/50～1/40得粗浓缩液；

(2)向粗浓缩液中加入10～15倍体积的PBS溶液，在压力为0.5～1.0bar，流速为1.8～2L/min的条件下持续透过300KD膜包，体积浓缩至透过前的1/4～2/5时调整流速为0.8～1L/min，持续浓缩至所述粗浓缩液原体积；

步骤(2)重复多次获得病毒浓缩液。