[发明专利]一种可获得高活性软骨细胞的消化液

权利要求书

1.一种可获得高活性软骨细胞的消化液，其特征在于：以完全培养基为基础液体，所述的可获得高活性软骨细胞的消化液含有以下成分：

Ⅱ型胶原酶 0.1~0.2g/L

Ⅳ型胶原酶 0.05~0.5g/L

人血白蛋白 5~20g/L

细胞保护剂 2~8g/L。

2.根据权利要求1所述的一种可获得高活性软骨细胞的消化液，其特征在于：所述的基础液体为8v/v％的血清的DMEM培养基。

3.根据权利要求2所述的一种可获得高活性软骨细胞的消化液，其特征在于：所述的DMEM培养基中含有氯化钙、硝酸铁、氯化钾、硫酸镁、氯化钠、磷酸二氢钾、丁二酸、丁二酸那、L-盐酸精氨酸、L-盐酸胱氨酸、甘氨酸、L-盐酸组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-盐酸赖氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸、D-泛酸钙、酒石酸胆碱、叶酸、肌醇、烟酰胺、核黄素、盐酸硫胺、盐酸吡哆辛、葡萄糖、丙酮酸钠和酚红。

4.根据权利要求1所述的一种可获得高活性软骨细胞的消化液，其特征在于：所述的Ⅳ型胶原酶的分子量为68~130KD。

5.根据权利要求1所述的一种可获得高活性软骨细胞的消化液，其特征在于：所述的人血白蛋白是质量分数为5wt%100mL或者质量分数为20wt%50mL的人血白蛋白注射剂。

6.根据权利要求1所述的一种可获得高活性软骨细胞的消化液，其特征在于：所述的细胞保护剂为美司钠、石雷佐生或者氨磷汀中的至少一种。

7.根据权利要求1所述的一种可获得高活性软骨细胞的消化液，其特征在于：所述的消化液的使用方法如下：

S1选取不同年龄组组织的活力高的兔子，耳静脉空气注射法处死后，无菌条件下分离后肢关节软骨和肋软骨，剥离包裹软骨组织的筋膜和软骨膜，放入盛有PBS液的培养皿中；

S2将分离得到的软骨组织剁碎成0.3~0.5mm的组织块，移入25cm²培养瓶，用含双抗的PBS液冲洗软骨3次；

S3加入软骨体积10~15倍的消化液，37℃消化17~20小时；

S3在倒置显微镜下观察，当游离出单个细胞后，加入DMEM培养液将II型胶原酶稀释终止消化；

S4将细胞团吹打成单个细胞后用150~250目滤网过滤，收集滤液，1000~2000r/min离心2~8min；

S5弃上清，加入DS培养液重悬，0.1~0.3%台盼蓝染色，活细胞率90~95%，CO₂培养箱孵育。