[发明专利]一种利用小分子化合物提高基因组定点插入效率的方法

说明书

本发明涉及基因工程技术领域，特别涉及一种利用小分子化合物提高基因组定点插入效率的方法。该方法通过小分子化合物与CRISPR/Cas9系统共同作用于细胞来实现。具体地为，是在CRISPR/Cas9系统包含目的基因gRNA片段，可以定点识别目的基因，并使目的基因发生双链断裂，而在断裂处，小分子化合物发挥作用，进行同源重组修复，高效的完成基因组定点插入，经小分子化合物处理的细胞基因组定点插入效率显著提高。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域。具体地说，本发明涉及一种利用小分子化合物提高基因组定点插入效率的方法。

背景技术

随着越来越多物种基因组测序的完成，探索基因组功能或对基因组进行定点改造已成为科学研究的重点之一。传统的基因操作技术是将目的基因随机插入到基因组内，这种随机插入的方式会对后期基因编辑动物或人类疾病模型研究带来较大困难，而基因组定点修饰技术可以实现对特定基因进行改造，在研究基因功能或培育具有特定性状的动物群体，以及制备人类疾病动物模型和治疗药物研发等方面具有重要的应用价值，已成为基因组改造与基因功能研究的重要手段。

CRISPR/Cas9系统由一条外源单链向导RNA(sgRNA)和Cas9蛋白组成，sgRNA通过碱基互补配对原则识别基因组序列，并引导Cas9蛋白结合靶点处产生基因组双链断裂(Double strand break,DSB)。同时细胞激活体内非同源末端连接(Nonhomologousendjoining,NHEJ)或同源定向修复 (Homologous-directed repair,HDR)两种不同的修复机制，实现内源基因的敲除或外源基因的定点敲入。虽然CRISPR/Cas9产生DSB效率得到了一定的保障，但由HDR介导的定点插入效率仍然十分低下，因此迫切需要寻找提高基因组定点插入效率的方法。

发明内容

根据本公开的一个方面，提供了一种利用小分子化合物提高基因组定点插入效率的方法，该方法通过小分子化合物与CRISPR/Cas9系统共同作用于细胞来实现。具体地为，是在CRISPR/Cas9系统包含目的基因gRNA 片段，可以定点识别目的基因，并使目的基因发生双链断裂，而在断裂处，小分子化合物发挥作用，进行同源重组修复，高效的完成基因组定点插入，经小分子化合物处理的细胞基因组定点插入效率显著提高。

在某些实施方式中，该方法通过如下步骤来实现：

CRISPR/Cas9载体和供体质粒的构建；

表达细胞系的培养；

CRISPR/Cas9系统表达载体与小分子化合物共转染表达细胞，筛选出可提高细胞基因组定点插入效率的小分子化合物；

将筛选出的小分子化合物与CRISPR/Cas9系统共处理细胞，来提高基因组定点插入效率。

由此，CRISPR/Cas9系统表达载体中的gRNA通过碱基互补配对原则识别报告载体上序列，使报告基因产生双链断裂，采用小分子化合物处理获得的表达细胞系，进行同源重组修复，对报告基因进行定点插入，可筛选出提高基因组定点插入效率的小分子化合物，将筛选出的小分子化合物与CRISPR/Cas9系统共处理目的细胞，可显著提高细胞的基因组定点插入效率。

在某些实施方式中，CRISPR/Cas9载体质粒为PX330-ACTB质粒。由此，CRISPR/Cas9系统切割ACTB基因产生DSB，为基因组的定点插入提供插入位点。

在某些实施方式中，PX330-ACTB质粒的序列为SEQ ID No:4。由此， CRISPR/Cas9系统切割序列SEQ ID No:4产生DSB，为基因组的定点插入提供插入位点。