[发明专利]固定化酶催化法制备D-核酮糖有效
申请号: | 201910784329.4 | 申请日: | 2019-08-23 |
公开(公告)号: | CN110452942B | 公开(公告)日: | 2021-01-12 |
发明(设计)人: | 黄华;张传封;巫欣欣 | 申请(专利权)人: | 华南师范大学 |
主分类号: | C12N11/089 | 分类号: | C12N11/089;C12N11/18;C12P19/02;C12P19/24 |
代理公司: | 广州市华学知识产权代理有限公司 44245 | 代理人: | 郭炜绵 |
地址: | 510631 广东省广州市天河*** | 国省代码: | 广东;44 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 固定 催化 法制 核酮糖 | ||
本发明公开了固定化酶催化法制备D‑核酮糖,该方法先扩增、发酵生产D‑核酮糖代谢途径中所需的系列酶,接着对酶做纯化和固定,再加入起始原料,合成D‑核酮糖。本发明方法采用系列酶连续地将D‑葡萄糖酸转化成2‑氧‑D‑葡萄糖酸、3‑氧‑D‑葡萄糖酸、3‑氧‑D‑葡萄糖酸‑6‑磷酸以及D‑核酮糖‑5‑磷酸,比较完全地将D‑葡萄糖酸一步转化成最终产物。并通过在反应体系引入乳酸脱氢酶与丙酮酸,ATP再生酶与多聚磷酸,则能循环再生辅酶,从而有效降低这些昂贵的辅酶的用量。
技术领域
本发明属于生物技术领域,具体涉及固定化酶催化法制备D-核酮糖,利用多个固定化酶连续转化D-葡萄糖酸得到D-核酮糖。
背景技术
核酮糖(Ribulose)是一种五碳酮糖,其对应的醛糖是核糖(Ribose),该酮糖含有D,L两种构型,分子式为C5H10O5,分子量150。
D-核酮糖是生物体内普遍存在的戊糖代谢通路(Pentose Phosphate Pathway)里重要的中间体,是很多活性物质生物合成的起始原料。核酮糖的衍生物核酮糖-5-磷酸以及核酮糖-1,5-二磷酸在植物光合作用的暗反应中非常重要;此外,在人体的粪便中就检测D/L-核酮糖的存在,证明人体微生物能产生该类物质。
然而昂贵的价格一直严重地制约核酮糖理论及应用研究(D-核酮糖:¥9000元/克),因而开发一种简易的、能批量生产核酮糖的方法以降低其成本变得很重要。
目前核酮糖常用的制备方法有分离法、化学合成法及酶催化法。虽然自然界中核糖非常丰富,但其酮糖含量很低,再加上其它大量类似糖类分子的存在,天然产物分离制备该水溶性小分子单糖非常繁琐,并且无法放大。
糖的化学合成工艺研究历史悠久,但是由于糖的多个手性中心及该类化合物的特殊物理性质导致该领域研究进展缓慢,无论是从其醇糖(阿糖醇)氧化或是从核糖异构化,多步的羟基选择性保护/脱保护导致核酮糖制备成本居高不下;因此生物转化成为核酮糖制备的必然选择。
虽然不少文献公开报道了利用异构酶或者是氧化酶制备核酮糖的可能性,但由于未综合考虑原料成本、纯化工艺以及实际放大生产的可行性,因而无法实现廉价生产。
发明内容
为了克服现有技术无法低成本地、便捷地制备高纯度D-核酮糖的缺陷,本发明的目的在于提供固定化酶催化法制备D-核酮糖。
本发明的目的通过下述技术方案实现:
一种制备D-核酮糖的方法,本发明方法所涉及的代谢途径如下所示:
具体包括以下步骤:
(1)PCR扩增D-葡萄糖酸脱氢酶(GDH)、酮酸异构酶(GIS)、酮酸激酶(GK)、酮酸脱羧酶(GDC)、乳酸脱氢酶(LDH)、ATP再生酶(PPK)和磷酸水解酶(AP)的基因片段,将所得基因片段分别连接到质粒上,转入细胞中;细胞做抗性筛选,然后逐级扩大培养并诱导蛋白表达,分别收集含有上述各种酶的湿细胞;
所述的PCR扩增,是以大肠杆菌(Escherichia coli DH5a)菌株gDNA、放射形土壤杆菌(Agrobacterium radiobacter K84,ATCC BAA868)染色体为模板;
所述的质粒优选pET28a;
所述的细胞优选E.coli BL21(DE3)菌株;
步骤(1)中,所述做抗性筛选和扩大培养采用的培养基都是LB液体培养基;做抗性筛选的培养基中还含有50μM卡那霉素;
所述的扩大培养,培养基中含有0.5mM IPTG,37℃诱导表达6小时;
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