[发明专利]扁果枸杞中与逆境胁迫响应相关基因及其编码蛋白和克隆方法

权利要求书

1.扁果枸杞中与逆境胁迫响应相关基因，其特征在于：所述与逆境胁迫响应相关基因为醛脱羰基酶基因LbCER1；作为优选，所述LbCER1基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1；或，与SEQ ID NO.1所示核苷酸序列相似性在90％以上的基因。

2.根据权利要求1所述的扁果枸杞中与逆境胁迫响应相关基因，其特征在于：所述醛脱羰基酶基因LbCER1编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2。

3.权利要求1或2所述的扁果枸杞中与逆境胁迫响应相关基因的克隆方法，其特征在于：包括如下步骤：幼苗培养，叶总RNA提取及反转录合成第一链cDNA，设计核心片段的引物，以上述cDNA为模板，通过PCR扩增得到核心片段产物，将产物回收后克隆入T载体，转化至感受态细胞诱导表达，筛选阳性克隆并测序，得到核心片段序列；再由5’-RACE法和3’-RACE法克隆得到5’和3’片段序列；通过序列拼接得到醛脱羰基酶基因LbCER1基因的核苷酸序列；

作为优选，所述感受态细胞为大肠杆菌DH5α。

4.根据权利要求3所述的扁果枸杞中与逆境胁迫响应相关基因的克隆方法，其特征在于：所述幼苗培养方法包括以下步骤：3周龄扁果枸杞幼苗用含有80mmol/L D-山梨醇的1/2Hoagland营养液渗透处理24h。

5.根据权利要求3所述的扁果枸杞中与逆境胁迫响应相关基因的克隆方法，其特征在于：所述核心片段产物制备方法为：以序列为5’-CATCAYCAYTCWATTGYWACWGARCC-3’的P1引物为上游引物，以序列为5’-CAACWGCYARDCTRCTTCCRTCYACC-3’的引物P2为下游引物，PCR程序为94℃预变性3min；94℃变性30s，54.5℃退火30s，72℃延伸90s，30个循环；72℃延伸10min；

其中，P1引物中，Y，W，R为简并引物，Y为C/T，W为A/T，R为A/G。

P2引物中，W，Y，R，D为简并引物，W为A/T，Y为C/T，R为A/G，D为A/G/T。

6.根据权利要求3所述的扁果枸杞中与逆境胁迫响应相关基因的克隆方法，其特征在于：所述RACE法克隆5’端时，以序列为5'-GATTACGCCAAGCTTAGCTGCTTCCGTCTACCACCTTCA-3'的引物GSP1为上游引物，以序列为5'-GATTACGCCAAGCTTAGCATCAGGCACTTCAGCTTCCC-3'的引物NGSP1为巢式下游引物。

7.根据权利要求3所述的扁果枸杞中与逆境胁迫响应相关基因的克隆方法，其特征在于：所述RACE法克隆3’端时，以序列为5'-GATTACGCCAAGCTTCCTTGGCCTCGGAGCCTCACACCT-3'的引物GSP2为上游引物，以序列为5'-GATTACGCCAAGCTTAGCTGAGTGAGGTGGTAGACGG-3'的引物NGSP2为巢式下游引物。

8.用qRT-PCR法分析权利要求1或2所述的扁果枸杞中与逆境胁迫响应相关基因转录丰度的方法，其特征在于：所述qRT-PCR反应体系中包括内参基因LbACT的上下游引物以及内参基因LbCER1基因的的上下游引物；所述内参基因LbACT的上游引物QA1序列为5’-CTATGAGTTGCCAGATGGACAG-3’，下游引物QA2序列为5’-TGGCTGGAAAAGGACTTCTG-3’；所述LbCER1基因的的上游引物QC1序列为5’-CACTGGGACTGCCTCTATGG-3’，下游引物QC2序列为5’-GTAGTGAGTGGTACGAGGGC-3’；所述qRT-PCR反应的程序为95℃预变性30s，95℃变性5s，60℃退火30s，72℃10s，40个循环。

9.权利要求1或2所述的扁果枸杞中与逆境胁迫响应相关基因在渗透胁迫、盐胁迫下转录丰度提高。

10.权利要求1或2所述的扁果枸杞中与逆境胁迫响应相关基因在制备抗逆、抗盐胁迫或抗旱的转基因植物中的应用。