[发明专利]固定化酶催化法合成D-木酮糖

权利要求书

1.一种合成D-木酮糖的方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)以大肠杆菌DH5a菌株gDNA、包皮垢分支杆菌ATCC 700084染色体为模板，利用引物PCR扩增出木糖异构酶XI、木糖醇氧化酶XDH、木酮糖激酶XK、乳酸脱氢酶LDH、ATP再生酶PPK以及磷酸水解酶AP基因片段，然后通过酶切连接到pET28a质粒上，转入细胞中；细胞做抗性筛选，然后逐级扩大培养并诱导蛋白表达，分别收集含有上述各种酶的湿细胞；

所述引物序列如下：

XI正向引物:5’-gattatggagttccatatgcaagcctattttg-3’

XI反向引物:5’-cgatatacatctcgagcgttccttaaaaaaatg-3’

XK正向引物:5’-gaaggacggacatatgacgtacctcctgaac-3’

XK反向引物:5’-gtcggtcgggcctcgagccgggtgaggtgc-3’

XDH正向引物:5’-gtcgaaaggtatttcatatgtccaatcaag-3’

XDH反向引物:5’-ctcggctcatcacagaagctttcgctatgc-3’

LDH正向引物:5’-catcactggagaaagtcatatgaaactcg-3’

LDH反向引物:5’-gaatgcaggggagcctcgagattaaaccag-3’

PPK正向引物:5’-gagcgggaggaagcatatggcactcgacg-3’

PPK反向引物:5’-ctgatcgtcagctcgagggaatcacctgag-3’

AP正向引物:5’-catggagaaaatcatatgaaacaaagcac-3’

AP反向引物:5’-aattcactgccgggctcgagtttatttcagc-3’；

(2)将收集的湿细胞高压破碎、离心，在上清液中逐量加入硫酸铵直至蛋白固体析出；离心收集蛋白，纯化，分别得到木糖异构酶XI、木糖醇氧化酶XDH、木酮糖激酶XK、乳酸脱氢酶LDH、ATP再生酶PPK、磷酸水解酶AP液体酶；

(3)将木糖异构酶XI、木酮糖激酶XK、ATP再生酶PPK按活性单位比1.0:(1.5～3.0):(3.0～6.0)溶解在缓冲液中，随后加入环氧树脂，室温搅拌8小时以上，将酶固定在环氧树脂上，得到固定化混合酶1；

将木糖醇氧化酶XDH、木酮糖激酶XK、ATP再生酶PPK、乳酸脱氢酶LDH四种酶按活性单位比1.0:(1.5-3.0):(3.0-6.0):(2.0-4.0)溶解在缓冲液中，随后加入环氧树脂，室温搅拌8小时以上，将酶固定在环氧树脂上，得到固定化混合酶2；

将磷酸水解酶AP溶解在缓冲液中，随后加入环氧树脂，室温搅拌8小时以上，将酶固定在环氧树脂上；

步骤(3)所述的缓冲液是pH值8.0的磷酸钾溶液；

(4)在缓冲液中加入D-木糖、三磷酸腺苷二钠盐、多聚磷酸、氯化镁和氯化钾，调节pH值到6.5–8.5，加入固定化混合酶1，维持体系pH值在6.5-8.5，30℃搅拌3-5小时，过滤回收固定化酶，所得D-木酮糖-5-磷酸粗液进行纯化；

在缓冲液中加入D-木糖醇、丙酮酸钠、三磷酸腺苷二钠盐、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸单钠盐、多聚磷酸、氯化镁和氯化钾，调节pH值到6.0-9.0，加入固定化混合酶2，维持体系pH值在6.0-9.0，30℃搅拌2.5-5.5小时，过滤回收固定化酶，所得D-木酮糖-5-磷酸粗液进行纯化；

步骤(4)所述的缓冲液是pH值8.0的Tris.HCl溶液；

步骤(4)所述的D-木酮糖-5-磷酸粗液进行纯化，包括以下步骤：

往D-木酮糖-5-磷酸粗液中加入木糖或木糖醇1.1当量的草酸钡并搅拌充分，随后混入两倍过滤液体积的乙醇溶液沉淀所有含磷酸成分，离心收集沉淀并将之溶解在pH值1.0的Tris缓冲溶液中，再加入草酸钡等当量的无水硫酸钠，离心除去BaSO₄沉淀，调节上清液pH值至7.0，用D201阴离子交换树脂除去腺苷杂质，最后G25尺寸排阻柱脱盐、冻干得到白色固体即为D-木酮糖-5-磷酸钠纯品；

(5)将D-木酮糖-5-磷酸钠和氯化镁加入缓冲液中，再加入固定化磷酸水解酶AP，20-40℃反应1.5-3.5个小时，然后过滤回收固定化磷酸水解酶AP，滤液过阴离子交换树脂除去含磷酸杂质，D-核酮糖最先被洗脱出；最后经纯化得到D-木酮糖纯品；

步骤(5)所述的缓冲液是pH值7.0的Tris.HCl溶液。