[发明专利]一种应用斜生栅藻测试磺胺类抗生素生物毒性的方法

说明书

本发明公开了一种应用斜生栅藻测试磺胺类抗生素生物毒性的方法。以磺胺类抗生素为研究对象，以斜生栅藻为测试生物，以96孔微孔板为载体，通过96孔微孔板加样分析方法，加样96h后采用多功能酶标仪测试681nm处斜生栅藻的吸光值，利用实验组与对照组的吸光值来计算斜生栅藻的生长抑制率，利用基于Matlab自编的Logit函数拟合计算出的EC₅₀值的负对数pEC₅₀，以pEC₅₀值为毒性指标判断磺胺类抗生素的毒性大小。本发明方法操作简单，方便快捷，重现性好，能够广泛适用于测试磺胺类抗生素的毒性。

技术领域

本发明属于磺胺类抗生素生物毒性检测领域，特别涉及一种应用斜生栅藻测试磺胺类抗生素生物毒性的方法。

背景技术

抗生素是一类能在低微浓度情况下抑制或影响生物机能的化学物质，在医疗及动、植物病虫害防治方面发挥了巨大的作用。抗生素按使用对象，可分为人用抗生素和兽用抗生素，磺胺类药物是一类人工合成的抗菌剂，自20世纪40年代磺胺类药物被合成成功以来，超过150种磺胺类药物和其衍生物被应用于人体疾病的治疗或作为兽药应用于动物饲养。由于这类药物在动物体内很难被完全吸收，大部分以母体或代谢产物的形式通过粪尿排出体外进入环境，导致药物在环境中的大量残留。目前磺胺类抗生素生物毒性的检测方法有：发光菌毒性试验、藻类毒性试验、溞类毒性试验和鱼类毒性试验等。

在所有水生生物中，藻类对磺胺类抗生素的毒性作用反应最为敏感，而藻类构成了食物链的基础，其种群数量的减少将直接影响整个水生生态系统的平衡。研究表明，几乎所有磺胺类药物均能对藻类产生毒性作用。藻类与周围环境形成统一的整体并且互相影响，因其个体微小（小于200μm）、生长周期短、对有毒物质反应灵敏、容易培养等特点，在较短的时间内可得到毒物对藻类许多世代及种群水平上的影响评价，自1980年以来就被看作是理想的实验材料。藻类作为磺胺类抗生素毒性检验的指示生物，具有快速简便，重现性好的优点。

发明内容

本发明的目的在于提供一种应用斜生栅藻测试磺胺类抗生素生物毒性的方法。

具体步骤为：

（1）将磺胺类抗生素标准品按照溶解度配成标准溶液，将标准溶液置于4℃冰箱保存待用。

（2）培养斜生栅藻使其达到对数生长期，用血球计数板在显微镜下计数，当藻密度为5×10⁵个/mL时，将其作为工作藻液。

（3）将步骤（1）配制的标准溶液加入到白色透明96孔微孔板中，设置好微孔板中磺胺类抗生素浓度梯度，然后向白色透明96孔微孔板中加入步骤（2）得到的工作藻液，制作磺胺类抗生素和工作藻液的反应体系，为防止产生边缘效应，周边孔每孔加入300μL超纯水，实验组每孔含100μL工作藻液和100μL不同浓度的磺胺类抗生素，空白对照组每孔含100μL工作藻液和100μL超纯水，每孔总体积为200μL；相同条件下，每个磺胺类抗生素浓度进行9次重复实验，并取平均值；采用多功能酶标仪测试在681nm下斜生栅藻的0h吸光值RLU；然后将96孔微孔板置于光照3000lux、温度22℃的光照培养箱中培养96h，再采用多功能酶标仪测试在681nm下斜生栅藻的吸光值RLU。

（4）利用实验组与空白对照组的吸光值来计算斜生栅藻的生长抑制率，以磺胺类抗生素的不同浓度为横坐标，以不同浓度对应的生长抑制率为纵坐标，利用基于Matlab自编的Logistic函数对不同浓度磺胺类抗生素与生长抑制率E进行非线性拟合：

；

式中：I₀为空白对照组的RLU平均值，I为实验组各浓度9次平行样的RLU平均值；最后，利用基于Matlab自编的Logit函数拟合计算出的EC₅₀值的负对数pEC₅₀，以pEC₅₀作为毒性指标，判断磺胺类抗生素的毒性大小，pEC₅₀的数值越大，毒性越大。