[发明专利]利用dU耐受型高忠实性DNA聚合酶的基因克隆方法

权利要求书

1.一种利用dU耐受型高忠实性DNA聚合酶的基因克隆方法，其特征在于，包括步骤为：（1）用dU修饰引物和dU耐受型高忠实性DNA聚合酶扩增目标基因和质粒载体，得到目标基因PCR产物和质粒载体PCR产物；（2）将目标基因PCR产物和质粒载体PCR产物用尿嘧啶DNA糖苷酶处理，再进行碱裂解，使目标基因和质粒载体的两端产生12-30bp 单链同源区域；（3）将步骤（2）得到的产物混合，使目标基因和质粒载体的两端单链区发生配对连接起来，形成含目标基因的带缺口环状重组质粒载体；（4）步骤（3）得到的含目标基因的带缺口环状重组质粒载体转化大肠杆菌后，所述含有目标基因的重组质粒载体的缺口被修复好，得到含目标基因的完整重组质粒载体。

2.根据权利要求1所述的利用dU耐受型高忠实性DNA聚合酶的基因克隆方法，其特征在于，步骤（1）中所述dU修饰引物的序列特征为：（a）扩增目标基因和质粒载体的正向引物5’端的第1-30位碱基序列彼此互补配对；（b）扩增目标基因和质粒载体的反向引物5’端的第1-30位碱基序列彼此互补配对；（c）引物长度40-50个碱基，3’端下游的18-25个碱基序列与目标基因和质粒载体的待扩增DNA片段两端碱基序列配对；（d）dU碱基位于1-30位碱基区，且每隔5-10个碱基为一个dU碱基。

3.根据权利要求1所述的利用dU耐受型高忠实性DNA聚合酶的基因克隆方法，其特征在于，步骤（1）中所述扩增采用的是聚合酶链式反应PCR，扩增反应缓冲液中包括有用于扩增目标基因的DNA片段的正向引物、用于扩增质粒载体的DNA片段的正向引物、用于扩增目标基因的DNA片段的反向引物、用于扩增质粒载体的DNA片段的反向引物、目标核酸模板分子、dU耐受型高忠实性DNA聚合酶、4种脱氧核苷三磷酸。

4.根据权利要求1所述的利用dU耐受型高忠实性DNA聚合酶的基因克隆方法，其特征在于，所述dU耐受型高忠实性DNA聚合酶，例如dU耐受型Pfu DNA聚合酶或dU耐受型KOD DNA聚合酶。

5.根据权利要求1所述的利用dU耐受型高忠实性DNA聚合酶的基因克隆方法，其特征在于，所述利用dU耐受型高忠实性DNA聚合酶的基因克隆方法在步骤（1）和步骤（2）之间还包括对质粒载体PCR产物用限制性核酸内切酶Dpn I消化。

6.根据权利要求1所述的利用dU耐受型高忠实性DNA聚合酶的基因克隆方法，其特征在于，步骤（2）中所述尿嘧啶DNA糖苷酶处理方法为：将PCR扩增的DNA片段用常温或耐热尿嘧啶DNA糖苷酶，在25-37度（常温尿嘧啶DNA糖苷酶）或45-75度（耐热尿嘧啶DNA糖苷酶）反应1-15分钟。

7.根据权利要求1所述的利用dU耐受型高忠实性DNA聚合酶的基因克隆方法，其特征在于，步骤（2）中所述碱裂解过程为：在10-200 mM的NaOH溶液中在50-100度加热1-10分钟，在无碱基位点处断裂DNA，产生3’末端单链DNA，再加入等量的HCl中和加入的NaOH。

8.根据权利要求1所述的利用dU耐受型高忠实性DNA聚合酶的基因克隆方法，其特征在于，步骤（3）中得到的产物混合是在4度到室温范围内，放置1-10分钟。

9.根据权利要求1所述的利用dU耐受型高忠实性DNA聚合酶的基因克隆方法，其特征在于，所述利用dU耐受型高忠实性DNA聚合酶的基因克隆方法还包括对含目标基因的完整重组质粒载体的鉴定：挑取单菌落，利用扩增目标基因的引物与Taq DNA聚合酶进行菌落PCR，鉴定含目标基因的完整重组质粒载体的阳性克隆，培养阳性克隆，并抽提含目标基因的完整重组质粒载体。