[发明专利]谷氨酸氧化酶突变体、双酶共表达载体及其应用

说明书

本发明公开了一种通过对L‑谷氨酸氧化酶进行定点突变，获得一种酶活明显提高的谷氨酸氧化酶突变体，共表达该突变体酶和过氧化氢酶构建重组工程菌株，以L‑谷氨酸盐为底物，在常温常压条件下制备α‑酮戊二酸。本发明所采用的工艺简单，具有高转化率、易分离纯化、生产条件温和、环境污染小等特点，具有较好的工业化应用前景。

技术领域

本发明涉及一种谷氨酸氧化酶突变体、双酶共表达载体及其应用，属于生物工程技术领域。

背景技术

α-酮戊二酸（α-KG）是一种重要的有机酸，在有机体细胞代谢中发挥着重要作用，也是合成多种糖类、氨基酸以及蛋白质等的重要前体物质，在食品、医药、饲料、化工和化妆品等行业中具有广阔的应用前景。近年来，α-KG广泛应用于运动营养饮料和保健品，α-KG经人体消化吸收后，体内过多的氨可以结合到α-KG上以减少氨中毒带来的问题，同时参与体内氮代谢等代谢过程。此外，α-KG也可作为体格增强剂，与鸟氨酸结合后，能提高生长激素、胰岛素的水平，而且可抑制肌纤维的分解、在减少蛋白质消耗的前提下起到修复肌肉损伤的作用, 具有较高的保健价值。

目前，α-KG的生产方法包括化学合成法、微生物发酵法和生物催化法。传统α-KG生产采用化学合成法，但化学合成工艺中所使用的强酸强碱、氰化物等有害试剂，不仅容易引起环境污染，更限制了其在食品、化妆品和医药等行业的应用。微生物发酵法发酵周期长，且发酵产物中丙酮酸、富马酸等副产物较多，会增加后续α-KG提取的难度和费用，尚未实现工业大规模生产。酶法生产α-KG具有反应周期短、转化率高等优势，牛盼清等通过诱变获得高产谷氨酸氧化酶的链霉菌突变株，在最优条件下转化24 h，α-KG产量可达38.1 g/L（牛盼清, 等. 生物工程学报, 2014, 8: 1318-22）；利用基因工程的方法，将谷氨酸氧化酶基因在大肠杆菌中异源表达，通过酶法催化，24 h生成α-KG产量104.7 g/L（Niu PQ, et al. JBiotechnol, 2014, 179:56-62）。利用纯化酶进行体外催化不仅需要经过繁琐的蛋白纯化步骤，而且反应过程中需外源添加大量昂贵的过氧化氢酶辅助催化，大大增加了工业成本。相比分离酶进行体外催化，全细胞生物催化剂更容易制备，催化性能更加稳定，不易受外界温度、pH等因素的影响；转化过程中不需外源添加辅助因子，且无有毒有害产物的生成，环境友好，具有工业化应用前景。

谷氨酸氧化酶 (L-glutamate oxidase, LGOX) 是一种以黄素腺嘌呤二核苷酸为辅基的黄素蛋白酶类，具有高度的底物立体异构选择性，催化效率高，反应条件温和，能在不添加外源性辅助因子的条件下氧化L-谷氨酸生成过氧化氢、氨和α-酮戊二酸。研究发现，该酶主要存在于链霉菌中，但产酶能力相差较大。发掘和鉴定具有高活性或底物特异性的谷氨酸氧化酶，并获得符合生理研究和生产应用要求的酶催化体系，将为工业生产α-KG提供有利条件。

发明内容

本发明的目的在于利用基因工程手段对微生物来源的L-谷氨酸氧化酶和过氧化氢酶进行共表达优化，构建出了催化性能优良的共表达重组菌株，并使用该菌株建立了高效生产α-KG的全细胞转化方法，如图1所示。

本发明的一个目的在于提供一种酶活提高的谷氨酸氧化酶突变体，是将对应于SEQ ID NO:1的第280位氨基酸由丝氨酸S突变为苏氨酸T的氨基酸序列；或者所述谷氨酸氧化酶突变体是进一步包括在对应于SEQ ID NO:1的第533位氨基酸由组氨酸H突变为亮氨酸L的双位点突变的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述谷氨酸氧化酶突变体包括如SEQ IDNO:5所示的氨基酸序列，所述谷氨酸氧化酶突变体的编码核苷酸序列可以是SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列；在另一个实施方案中，所述谷氨酸氧化酶突变体包括如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列，所述谷氨酸氧化酶突变体的编码核苷酸序列可以是SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列。本发明所述谷氨酸氧化酶突变体编码核苷酸序列可以是来源于SEQ ID NO:2所示的野生型的L-谷氨酸氧化酶编码核苷酸序列，例如所述突变体的编码核苷酸序列可以是SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列经突变或特定位点的核苷酸被取代而得到。