[发明专利]脂肪间充质干细胞的制备方法

说明书

本发明提供一种脂肪间充质干细胞的制备方法，涉及干细胞与再生医学领域。该脂肪间充质干细胞的制备方法，包括以下步骤：脂肪组织预处理：用组织清洗液将采集的脂肪组织清洗至无血液残留，将清洗后的脂肪组织剪碎，得到脂肪微粒；消化：向脂肪微粒中加入脂肪组织消化液进行第一次消化，加入胰蛋白酶进行第二次消化，第二次消化后离心，去除上清液收集沉淀；其中，所述脂肪组织消化液包括DNA酶、I型胶原酶和Ⅲ型胶原酶；清洗：将沉淀清洗干净，筛去组织块，离心得到脂肪间充质干细胞。本发明的方法得到的脂肪间充质干细胞的数量多、纯度高、活性好。

技术领域

本发明涉及干细胞与再生医学领域，特别是涉及脂肪间充质干细胞的制备方法。

背景技术

骨髓间充质干细胞(BMSC)，是人们在哺乳动物的骨髓基质中发现的一种具有分化形成骨、软骨、脂肪、神经及成肌细胞的多种分化潜能的细胞亚群，临床上用于治疗多种疾病。2012年1月，韩国FDA批准的自体脂肪干细胞药物Cytori Therapeutics成功上市，用于治疗复杂性克隆氏病并发肛瘘。同年10月美国FDA批准了Cytori Therapeutics公司脂肪干细胞对心脏衰竭患者有效性的临床试验。2012年有研究显示关节腔内注射骨髓间充质干细胞可以使OA模型动物关节软骨再生。2012年另外一项研究证实骨髓间充质干细胞可以缓解羊骨关节炎病情及改善软骨组织缺损。但是，BMSC取材困难，而且细胞增殖活性随着年龄增长而逐渐降低。

脂肪组织中含有一类具有多向分化潜力的细胞，即脂肪组织血管基质细胞(SVF)，SVF中包括脂肪间充质干细胞(MSC)，其生物学性质与骨髓间充质干细胞类似，可向脂肪、骨、软骨、肌肉内皮、造血、肝、胰岛和神经等多种细胞方向分化。脂肪组织在人体内储存量丰富，获取简便、创伤小。同样质量或体积的脂肪组织和骨髓组织，脂肪组织的数量远高于骨髓组织的数量。SVF细胞的增殖能力受年龄影响较小，其扩增能力比BMSC更强，在细胞连续培养扩增过程中，BMSC比SVF更容易发生早期衰老现象。而且，异体SVF相比于异体BMSC，异体SVF免疫反应更弱。因此，间充质干细胞能够替代一部分骨髓间充质干细胞，其具有更广阔的临床应用前景。

脂肪间充质干细胞一般是通过抽取人体脂肪组织获取，在抽取脂肪组织后需要进行分离处理才能获得可应用的脂肪间充质干细胞，但是现有的处理方法提取率低，得到的细胞纯度和活性也较低。

发明内容

基于此，有必要针对现有获取脂肪间充质干细胞的方法提取率低、纯度低的问题，提供一种脂肪间充质干细胞的制备方法，从脂肪组织中提取脂肪间充质干细胞的提取率高，纯度高。

一种脂肪间充质干细胞的制备方法，包括以下步骤：

脂肪组织预处理：用组织清洗液将采集的脂肪组织清洗至无血液残留，将清洗后的脂肪组织剪碎，得到脂肪微粒；

消化：向脂肪微粒中加入脂肪组织消化液进行第一次消化，加入胰蛋白酶进行第二次消化，第二次消化后离心，去除上清液收集沉淀；其中，所述脂肪组织消化液包括DNA酶、I型胶原酶和Ⅲ型胶原酶；

清洗：将沉淀清洗干净，筛去组织块，离心得到脂肪间充质干细胞。

上述制备方法，对脂肪组织采用两步消化，充分的将脂肪组织消化，并获得丰富的有核细胞，从而使脂肪间充质干细胞得率高、纯度高、活性好，有利于应用于临床。

在其中一个实施例中，所述脂肪组织消化液包括以下使用浓度的组分：DNA酶0.02～0.05mg/mL，I型胶原酶0.4～0.6mg/mL，Ⅲ型胶原酶0.4～0.6mg/mL，溶剂为含双抗的DMEM培养基；所述含双抗的DMEM培养基中的双抗为0.5～1.0μg/mL的硫酸庆大霉素和0.5～1.0μg/mL两性霉素B。本发明选用DNA酶、I型胶原酶和Ⅲ型胶原酶作为脂肪组织消化液的组分，其中DNA酶可以分解DNA，排除DNA污染现象，I型胶原酶和Ⅲ型胶原酶搭配，能够更好的将脂肪组织充分的消化。以备获得更多，纯度跟高的脂肪间充质干细胞。