[发明专利]曼氏血吸虫虫卵可溶性抗原的制备及其ELISA检测试剂盒

权利要求书

1.一种适合曼氏血吸虫虫卵分离纯化的方法，所述方法为：

(1) 曼氏血吸虫尾蚴感染适宜宿主，宿主包括但不限于小鼠；

(2)取感染6至10周的宿主动物器官，用于虫卵的制备；

(3)分离及纯化曼氏血吸虫的虫卵。

2.如权利要求1所述的适合曼氏血吸虫虫卵分离纯化的方法，具体为：

感染后60d解剖小鼠，取各鼠的胃、肝脏、脾脏、肠等内脏组织，仔细分离除去粘附于各组织的血管、肠系膜等外在组织；将肠根据功能细分成小肠、盲结肠、直肠三段，其中小肠再均等地细分成上、下二段，清空肠道内容物；

剖杀，取肝脏等生物材料，剔除血管等结缔组织后剪成1g左右的小块，每鼠肝脏等生物材料加5-15ml（最适10ml）生理盐水（pH值应为7.0～7.5），常温下采用搅碎机制成匀浆液，匀浆转速500-2000r/min，（最适2000r/min）匀浆时间1分钟，间歇3分钟，重复上述操作1-5次（最适合3次），获得含虫卵的肝脏等生物材料匀浆液；

上述肝脏等生物材料匀浆液按1:1-5比例（最适合1:1）加入45-60℃预热的10%NaOH溶液（最适合50℃，下同），混匀，置于45-60℃水浴振荡器内消化5-15分钟（最适合8分钟），震荡转速50-200r/min（最适合100r/min），消化结束后，迅速将消化的匀浆液插入2～8℃的冰水里降温，3000r/min离心1-5分钟，2～8℃操作，弃上清，加PBS(0.01M pH6.8)重悬沉淀后，重复上述操作离心洗涤1-3次（最适合3次），加PBS(0.01M pH7.2)重悬沉淀后，重复上述操作离心洗涤1-3次；最后用生理盐水(0.9%NaC)重悬沉淀后，重复上述操作离心洗涤1-3次，收集虫卵；

上述组织分别称重后放入离心管中，加适量的蒸馏水，定容后用高速匀浆机匀浆，用细胞计数板计数虫卵数，每样计数三次。

3.一种曼氏血吸虫虫卵可溶性抗原的制备方法，所述方法为：

（1）将洗涤后离心获得的虫卵沉淀加按照1:1-5的体积比加入生理盐水，研磨器内粉碎，镜检无完整虫卵；-40℃至10℃反复冻融3次，冰上超声，超声1秒间隔9秒，共0.5-1小时，超声后12000r/min离心5分钟，取可溶性上清，即为虫卵可溶性抗原粗提物，-20℃冻存；

生产前，将虫卵可溶性抗原再次12000r/min离心5分钟，上清即为检测用虫卵可溶性抗原；

（2）对虫卵可溶性抗原的检验，其中上清性状应为清亮半透明的液体；浓度检测：通过Folin-酚试剂法测定抗原浓度应不低于1mg/ml。

4.如权利要求3所述的一种曼氏血吸虫虫卵可溶性抗原的制备方法，所述方法的最优反应条件为：

将洗涤后离心获得的虫卵沉淀加按照1:3的体积比加入生理盐水，研磨器内粉碎，镜检无完整虫卵；-40℃至10℃反复冻融3次，冰上超声，超声强度500w，超声1秒间隔9秒，共0.5-1小时，超声后12000r/min离心5分钟，取可溶性上清，即为虫卵可溶性抗原粗提物，-20℃冻存；

生产前，将虫卵可溶性抗原再次12000r/min离心5分钟，上清即为检测用虫卵可溶性抗原。

5.一种曼氏血吸虫虫卵纯化抗原，其特征在于，采用根据权利要求3或4所述的一种曼氏血吸虫虫卵可溶性抗原的制备方法制备而成。

6.根据权利要求5所述的血吸虫虫卵纯化抗原在制备检测血吸虫抗体的检测产品中的应 用。

7.一种权利要求5 所述的曼氏血吸虫虫卵纯化抗原在制备ELISA检测试剂盒中的应用。

8.如权利要求7所述的应用，所述ELISA检测试剂盒中虫卵可溶性抗原最佳包被浓度为0.5μg/ml；最佳封闭液为PBST稀释的5%的脱脂奶粉溶液；曼氏血吸虫阳性血清和阴性血清最适合稀释比为1:400。

9.一种非诊断目的的利用曼氏血吸虫虫卵纯化抗原进行ELISA检测的应用，所述应用包括：用包被液将虫卵可溶性抗原，成虫可溶性抗原稀释至0.05μg/ml、0.1μg/ml、0.25μg/ml、0.5μg/ml，100μl/孔包被于96孔板上，2～8℃包被过夜；PBST洗涤三次，加入用PBST稀释的5%的脱脂奶粉溶液，200μl/孔，37℃封闭2小时；PBST洗涤三次，加入1:100、1:200、1:300、1:400稀释的曼氏血吸虫阳性血清和血吸虫阴性血清，80μl/孔，37℃孵育1小时；PBST洗涤三次，分别加入1:2000倍PBST稀释的HRP标记的重组链球菌蛋白G，60μl/孔，37℃孵育30分钟；PBST洗涤三次，加入TMB进行显色，100μl/孔，37℃反应5分钟左右；加入2mol/L H2SO4终止反应，50μl/孔，读取OD450，计算P/N值，以P/N值≥2.1的血清判为阳性，以P/N值<2.1的血清判为阴性。