[发明专利]一种用于抗体酶标的双功能蛋白SPG-ALP

说明书

本发明提供一种用于抗体酶标的双功能蛋白SPG‑ALP，其特征在于：具有如SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列。本发明公开的重组蛋白，融合蛋白SPG‑ALP可高效、高密度的捕获目标分子，达到快速、高灵敏的检测，同时可以广谱结合包括人及多种动物总IgG及不同亚类的IgG，与现有技术中的免疫球蛋白结合分子相比，它结合力也比现有的免疫球蛋白结合分子高。

技术领域

本发明涉及一种重组蛋白，特别涉及一种兼有IgG 结合活性及ALP活性的双功能蛋白SPG-ALP及其应用。

背景技术

链球菌蛋白G（SPG）是能与人及多种动物的抗体IgG结合的一种链球菌细胞壁蛋白，最早由Kronvall在1973年报道。A、C、G群链球菌的细胞壁及培养上清液中均含有该蛋白。SPG的结构从N段开始，有三个同源结构区域A1、A2、A3，每个同源结构都由24个氨基酸组成，同时这三个同源结构被51个氨基酸组成的同源区域B1、B2隔开，接着是一个间隔区域S，随后是55个氨基酸组成的同源结构区C1、C2、C3，它们之间又被D1和D2区所隔开，C3区之后为亲水区域W，最后为M区（Sjobring，1991）。有研究表明，SPG的三个同源的氨基酸序列C1、C2和C3区域抗体IgG Fc端的结合相关，并且C1和C2区只有2个氨基酸序列不同，C1和C3区有6个氨基酸序列不同，并且C3区与抗体IgG的结合能力相当于C1区的7倍（Kobatake，1990）。而SPG的A、B区则具有与抗体Fab段结合以及与血清白蛋白结合的活性，被认为会起到干扰抗体与抗原的作用以及带来非特异性反应的问题。

碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)是非特异性磷酸单酯酶，可以催化几乎所有的磷酸单酯的水解反应，生成无机磷酸和相应的醇、酚、糖等，还可以催化磷酸基团的转移反应。ALP存在于除高等植物外几乎所有的生物体内，可直接参加磷代谢，在钙、磷的消化、吸收、分泌及骨化过程中发挥了重要的作用。

使用通过化学反应使碱性磷酸酶等酶和G蛋白结合而得的酶标记G蛋白，来代替标记二抗。G蛋白是来自链球菌的细胞壁的蛋白质，具有与几乎所有哺乳动物的IgG发生结合的性质。若使用这样的酶标记G蛋白，则能够与多种免疫种的一抗结合，即使在对多种目标物质(抗原)进行检测的情况下，也可以不准备与各物质分别特异性结合的抗体，通用性高。但是，使用用碱性磷酸酶等酶标记的酶标记G蛋白的方法存在检测灵敏度低的问题。此外，也存在热稳定性差的种类，有时会在处理中失活。碱性磷酸酶标记抗体或G蛋白等活性物质的方法，涉及到化学偶联，偶联后提纯，透析，浓缩等繁琐步骤；而且由于本身生物大分子的特点，偶联的结合位点多样，使得获得偶联的产品复杂化，难以保证产品的统一，不仅可能造成酶的失活，结合的生物大分子的失活，而且影响稳定性。

发明内容

本发明主要解决的技术问题是提供一种通用性高、检测灵敏度高、且稳定性高的蛋白质检测用融合蛋白及使用其的蛋白质检测方法。

为了实现上述技术方案，本发明提供一种融合蛋白，基于SPG C3区和ALP的特点，将这两段基因连接起来，重构一种兼有IgG 结合活性及ALP结合活性的双功能蛋白SPG-ALP。

一种兼有IgG 结合活性及ALP结合活性的双功能蛋白SPG-ALP，包括链球菌蛋白G（SPG）片段和ALP蛋白，所述链球菌蛋白G（SPG）片段为含有SPG的C3区段的序列；

其中，链球菌蛋白G（SPG）片段和ALP蛋白之间的连接序列为如SEQ ID NO.8所示

所述链球菌蛋白G（SPG）片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；

ALP蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；

所述双功能蛋白SPG-ALP的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；

对SPG和ALP序列进行密码子优化，拼接后蛋白表达量提高，可溶性增加。