[发明专利]一种高效利用发根农杆菌诱导朱砂根产生毛状根的方法

说明书

本发明提供了一种高效利用发根农杆菌诱导朱砂根产生毛状根的方法，属于植物组织培养技术领域。本发明所述方法包括如下步骤：(1)发根农杆菌的活化：(2)朱砂根组培无菌叶片毛状根诱导；(3)毛状根继代培养。本发明提供的方法具备操作简单、省时高效，朱砂根毛状根的诱导率高，能够获得朱砂根皂苷含量高的朱砂根毛状根，并能显著缩短其培养时间，为工业生产提供技术支持和科学依据，同时利于保护生态环境。

技术领域

本发明涉及遗传转化与植物组织培养技术领域，提供了一种朱砂根毛状根诱导方法，具体地说，是一种高效利用发根农杆菌诱导朱砂根产生毛状根的方法。

背景技术

朱砂根(Ardisia crenata Sims)是一种隶属于紫金牛科(Myrsinaceae)紫金牛属(Ardisia)的常绿小灌木，是中国传统的观赏药用植物，在《中国药典》(1997年版)中，朱砂根是被收载记录的紫金牛属2种药用植物之一，其种质资源丰富、分布广泛，在我国主要分布于湿润、温暖且荫蔽的长江流域以南各省区。朱砂根四季常青、观果期长，可作为室内观果、观叶盆栽植物，又因耐阴性强，或带植于荫蔽林下，或点缀露地吸水山石园，或运用在园林绿化的复合结构下层，而现代临床研究表明，朱砂根提取物具有多种显著药理特性，尤其是其根部积累的大量朱砂根皂苷具有显著减少癌细胞扩散或直接杀伤癌细胞等作用，有望成为下一代抗癌新药。因此，兼具观赏与药用价值的优良多功能型园林植物资朱砂根，具有多种生态与经济用途，在国家“乡村振兴”与“公园城市”建设以及医药行业中具有极大的开发潜力和广阔的市场应用前景。

三萜皂苷广泛分布于植物中，具有许多药理作用，如抗癌，抗病毒和抗炎活性，朱砂根皂苷是朱砂根中的三萜皂苷之一，但在植株体内的含量相对较低。因此，需开发提高该活性产物产量的技术。虽然目前已确定了朱砂根皂苷的提取和纯化技术，但该化合物的商业开发和利用仍面临着一个重要且实际的问题，即如何在不破坏野生植物资源和威胁该物种生存的情况下获得更多的朱砂根皂苷。愈伤组织培养是一种选择，但这些材料的获得本身需要时间。

朱砂根皂苷主要是在朱砂根的根中积累。因此，最有效的培养方法是直接获得根以替代整株挖根提取朱砂根皂苷，并缩短培养时间。但目前并无新方法提出以用于获得朱砂根皂苷高含量的朱砂根毛状根，并能显著缩短其培养时间。

发明内容

本发明的目的就是为了解决上述技术问题，而提供一种高效利用发根农杆菌诱导朱砂根产生毛状根的方法。本发明提供的方法具备操作简单、省时高效，朱砂根毛状根的诱导率高，能够获得朱砂根皂苷含量高的朱砂根毛状根，并能显著缩短其培养时间，为工业生产提供技术支持和科学依据，同时利于保护生态环境。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种高效利用发根农杆菌诱导朱砂根产生毛状根的方法，所述方法包括如下步骤：

(1)发根农杆菌的活化：

A、将-80℃保存的发根农杆菌菌株在YMB固体培养基(含Amp50mg·L^-1)上划线，于28℃恒温黑暗培养至长出单菌斑，挑单菌斑于YMB液体培养基(含Amp 50mg·L^-1)中，置于恒温振荡器中以180rpm、28℃恒温黑暗培养至液体浑浊；

B、重复进行2次上述A活化步骤中的划线、挑单菌斑、液体培养操作，共活化3次；在第3次活化进行液体培养时，于YMB液体培养基(含Amp 50mg·L^-1)中加入AS 100μmol·L^–1，测定菌液OD₆₀₀值至0.5～0.8时，即制备发根农杆菌感受态细胞，用于浸染介导转化；

(2)朱砂根组培无菌叶片毛状根诱导：