[发明专利]一种碱性磷酸酶活性的荧光检测方法

说明书

本发明涉及一种碱性磷酸酶活性的荧光检测方法，将4‑羟基苯基磷酸钠(4‑HPP)作为底物，在水溶液中，该底物分子经碱性磷酸酶的催化水解生成1,4‑苯二酚(HQ)，1,4‑苯二酚可以与后续加入的3‑(2‑氨基乙基氨基)丙基三甲氧基硅烷(DAMO)发生反应，生成绿色荧光发射的硅纳米粒子(SiNPs)。体系中的碱性磷酸酶活性越高，生成的荧光硅纳米粒子就越多，荧光强度就越大，根据检测溶液的荧光强度变化，进行碱性磷酸酶活性的定量分析检测。与现有技术相比，本发明所需试剂药品简单易得，操作方便，快速准确，为临床样品中碱性磷酸酶活性定量检测提供了一种灵敏可靠的方法。本发明的荧光检测方法，检出限为0.1mU/mL，具有高灵敏度，高选择性，宽线性范围等优点。

技术领域

本发明属于分析检测技术领域，具体涉及一种碱性磷酸酶活性的荧光检测方法。

背景技术

碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP，EC 3.1.3.1)是广泛分布于人体肝脏、骨骼、肠、肾和胎盘等组织经肝脏向胆外排出的一种酶，可以催化多种含磷酸酯基底物的去磷酸化过程，对于细胞生长、凋亡进程中的信号传导和细胞内调节有极其重要的作用。碱性磷酸酶是反映肝胆、骨骼等系统疾病的重要指标，当人体患有黄疽、肝癌、胆汁淤积性肝炎等疾病时，血清中的碱性磷酸酶含量将会明显升高；当发生骨折或患有骨软化症、佝偻病、骨细胞癌、骨质疏松等骨胳疾病时，血清中的碱性磷酸酶含量也会升高。因此，建立灵敏高效并能在临床血液中进行检测的碱性磷酸酶活性测定方法显得尤为重要。

一直以来，许多分析化学和检测技术的研究者致力于发展性能优良的分析方法用于碱性磷酸酶活性检测。传统检测碱性磷酸酶活性的方法包括同位素标记法，操作复杂，耗时低效，且需要危害较大的放射性同位素标记物。之后，研究者又基于色谱法，比色法，化学发光法，电化学法，荧光法，表面增强共振拉曼散射等不同的分析技术创建了一系列碱性磷酸酶活性的检测新方法。其中，荧光传感技术由于其简单灵敏、实时性和在体检测等优势，一直是人们的研究重点。目前的碱性磷酸酶荧光检测方法，大多数通过繁琐的有机合成，制备出较为复杂的底物分子，通过底物分子和碱性磷酸酶酶解产物之间的荧光差别来进行检测。然而，基于商业化的简单小分子，反应生成荧光物质的过程，构建的荧光“点亮”型生物分析技术，通常操作更加简便，背景干扰更低，检测灵敏度更高，因此基于这一原理发展的碱性磷酸酶检测技术具有更好的应用前景。

发明内容

本发明的目的是提供一种碱性磷酸酶活性的荧光检测方法，该检测方法所用试剂简单易得，操作方便，快速准确，灵敏度高。

为了实现上述目的，本发明的技术方案具体如下：

本发明提供一种碱性磷酸酶活性的荧光检测方法，包括以下步骤：

步骤一：将4-羟基苯基磷酸钠(4-HPP)水溶液分别与不同已知活性的碱性磷酸酶(ALP)标准溶液在缓冲溶液中混合孵育，得到一系列混合溶液；

步骤二：在步骤一制备的一系列混合溶液中分别加入3-(2-氨基乙基氨基)丙基三甲氧基硅烷(DAMO)水溶液，进一步混合孵育，进行荧光光谱测试；

步骤三：利用碱性磷酸酶标准溶液活性和荧光光谱强度的线性关系，绘制标准曲线；

步骤四：将4-羟基苯基磷酸钠(4-HPP)水溶液与待测碱性磷酸酶溶液在缓冲溶液中混合孵育，得到待测碱性磷酸酶混合溶液；

步骤五：在步骤四制备的待测碱性磷酸酶混合溶液中加入3-(2-氨基乙基氨基)丙基三甲氧基硅烷(DAMO)水溶液，进一步混合孵育，进行荧光光谱测试，得到待测碱性磷酸酶的荧光光谱强度；

步骤六：利用步骤三的标准曲线及步骤五测得的荧光光谱强度，计算得到待测碱性磷酸酶的活性。

在上述技术方案中，优选碱性磷酸酶标准溶液的活性范围为：0～50mU/mL。