[发明专利]一种特异性检测活细胞中的半胱氨酸的长波长发射荧光探针及其制备方法和应用

说明书

本发明属于荧光探针技术领域，提供了一种特异性检测活细胞中的半胱氨酸的长波长发射荧光探针及其制备方法和应用，荧光探针分子式为C₂₉H₂₆NO₅⁺，该探针化合物名称为2‑(4‑(丙烯酰氧基)苯基)‑4‑(2‑羧基苯基)‑7‑(二乙基氨基)苯并吡喃，简称PA‑A，以花色素衍生物为荧光团，以丙烯酸酯作为识别单元构建的特异性识别半胱氨酸的荧光探针。利用半胱氨酸与探针的迈克尔加成‑裂解反应进行高选择性检测。本发明属有机小分子荧光探针技术领域，探针颜色变化明显，水溶性好，能在水溶性环境、有机环境以及细胞环境中高效识别半胱氨酸。本发明方法操作简单、灵敏度高、选择性好，性质稳定，可以长期保存使用。

技术领域

本发明属于荧光探针技术领域，具体涉及一种特异性检测活细胞中的半胱氨酸的长波长发射荧光探针及其制备方法和应用，能够对半胱氨酸高选择性较灵敏识别，在水溶性、有机环境以及细胞环境中都有响应。

背景技术

近年来，含有巯基的氨基酸因为在调节生理和病理过程中起着至关重要的作用而引起了很多关注，包括半胱氨酸（Cys），高半胱氨酸（Hcy）和谷胱甘肽（GSH）。其中，半胱氨酸参与蛋白质合成，解毒和代谢，是一种重要的生物硫醇，与许多疾病有关。例如，缺乏半胱氨酸会导致儿童生长缓慢，水肿，嗜睡，肝损伤，肌肉和脂肪损伤，皮肤病变。过量的半胱氨酸也是引起心血管疾病和阿尔茨海默病的重要原因。

电化学分析法，质谱和高效液相色谱（HPLC）等分析方法都可用于检测半胱氨酸。然而，这些方法操作复杂且需昂贵的仪器。相比之下，荧光检测方法具有操作简单，灵敏度高，选择性好，实时监测的优点。另外，荧光探针可以通过非侵入性共聚焦方法对活细胞中的半胱氨酸成像，为将来进一步应用荧光探针提供了可能性。但是，半胱氨酸，高半胱氨酸和谷胱甘肽有着相似的结构和反应特性，它们几乎存在于所有哺乳动物细胞中，因此，半胱氨酸，高半胱氨酸和谷胱甘肽的选择性区分仍然是该领域的重要挑战。

目前，许多用于选择性检测半胱氨酸的小分子荧光探针已经建立在特定的化学反应基础上，如迈克尔加成，与醛环化，二硫化物交换和裂解反应，等等。 2011年，Strongin等人第一次使用丙烯酰基作为反应位点构建苯并噻唑衍生物，用于特异性识别半胱氨酸。从那时起，基于这种设计理念的荧光探针就被广泛开发。丙烯酰基在与半胱氨酸反应后，探针的丙烯酸酯单元被半胱氨酸切割以释放荧光信号单元，并且通过荧光信号增强实现半胱氨酸的高选择性检测。

发明内容

本发明提供了一种特异性检测活细胞中的半胱氨酸的长波长发射荧光探针及其制备方法和应用，合成一种新的荧光染料，与识别位点丙烯酰基结合后生成的新型探针可特异性地识别半胱氨酸，合成方法简便，可操作性强，选择性好，灵敏度高，可裸眼识别。

本发明由如下技术方案实现的：一种特异性检测活细胞中的半胱氨酸的长波长发射荧光探针，所述荧光探针分子式为C₂₉H₂₆NO₅⁺,该探针化合物名称为2-（4-（丙烯酰氧基）苯基）-4-（2-羧基苯基）-7-（二乙基氨基）苯并吡喃，简称PA-A，该荧光探针的结构式为：。

制备所述的特异性检测活细胞中的半胱氨酸的长波长发射荧光探针的方法，步骤如下：

（1）将间N-二乙胺基氨基苯酚与邻苯二甲酸酐溶解于苯中，130 ℃反应12 h，得白色固体；

（2）将步骤(1)所得白色固体与对羟基苯乙酮加入到甲磺酸的溶液中，90 ℃反应8 h，得到的固体用冰水和高氯酸处理后经过二氯甲烷萃取，最后经过柱层析分离后得到化合物1，其结构式如下：；

（3）将化合物1与丙烯酰氯在碱性环境三乙胺中，常温反应16 h后分离提纯得到荧光探针化合物PA-A。

步骤（1）中所述间N-二乙胺基氨基苯酚与邻苯二甲酸酐的摩尔比为1:1；每毫摩尔间N-二乙胺基氨基苯酚溶解于10-70 mL苯中。